Дицикловерин

 

 

Автореферат

на  тему:

Дицикловерин.

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                         

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Тонкослойная  хроматография.

   При разработке методики идентификации исследуемых веществ методом ТСХ было изучено их поведение на пластинках «Сорбфил» в хроматографических системах, широко используемых в химико-токсикологическом анализе группы «лекарственных ядов»:

- диоксан–хлороформ–ацетон–25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5) – общая система для идентификации веществ основного характера;

- толуол–ацетон–этанол–25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5) – универсальная  система для экспресс-анализа  острых интоксикаций;

-этилацетат–метанол–25% раствор  аммиака (17:2:1) – частная система  для обнаружения опийных алкалоидов.

  Поскольку в состав препарата «Триган Д» помимо дицикловерина гидрохлорида входит парацетамол, который может обнаруживаться в извлечениях из мочи, в обозначенных системах исследовался и стандартный раствор парацетамола.

   Значения Rf исследуемых веществ представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Значения Rf исследуемых веществ при хроматографировании на пластинках «Сорбфил» в различных системах растворителей (n=6)

Состав хроматографической системы

Дицикловерина гидрохлорид

толуол-ацетон-этанол-25% р-р аммиака	0,82±0,02
этилацетат-метанол-25% р-р аммиака	0,87±0,02
диоксан-хлороформ-ацетон-25% р-р аммиака	0,83±0,02

                                                                «Сорбфил» ПТСХ-П-В-УФ

                                                               «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ

толуол-ацетон-этанол-25% р-р аммиака	0,84±0,02
этилацетат-метанол-25% р-р аммиака	0,89±0,02
диоксан-хлороформ-ацетон-25% р-р аммиака	0,83±0,02

 

      Полученные  результаты свидетельствуют о  том, что исследуемое вещество  имеет удовлетворительное  значение  Rf во всех выбранных системах на обоих видах пластинок «Сорбфил». Значения Rf дицикловерина гидрохлорида указывает на их хорошее разделение в данных системах  в биологических пробах.

   С целью выбора оптимального способа детектирования зон адсорбции дицикловерина гидрохлорида  на хроматографических пластинках было изучено отношение исследуемых веществ к ряду потенциальных детектирующих агентов: УФ-свет (254, 365 нм), реактивы Драгендорфа (модифицированный по Мунье), Манделина, Марки, Фреде, железа (III) хлорида раствор 30%, реактив FPN, меди сульфата и калия йодида растворы 1 моль/л, меди сульфата раствор 10% и аммиака раствор 2% в соотношении 5:1.

    Оптимальный способ детекции компонентов препарата «Триган Д» заключается в поэтапной обработке хроматограммы:

-реактивом Драгендорфа – дицикловерин обнаруживается в виде пятна оранжево-коричневого цвета, окраска пятна парацетамола переходит из синей в оранжево-коричневую.

   При обработке реактивом Драгендорфа дицикловерина гидрохлорид обнаруживался при содержании в пятне 1 мкг и выше (предел обнаружения – 1 мкг).

Газо-жидкостная хроматография

   Исследования по установлению оптимальных условий газохроматографического определения дицикловерина гидрохлорида на хроматографе «Кристалл 2000М» сводились к выбору типа колонки (НЖФ), способа детектирования и режима программирования температуры анализа.

 На основе проведенных  исследований были выбраны следующие  условия анализа (рис. 1):

- колонка НР-5 (30 м × 0,25 мм);

- детектор – термоионный;

- температурный режим: температура детектора 280 °С; температура испарителя 260 °С; температура колонки программируемая: 160 °С – 2 минуты, подъем до 240 °С со скоростью 20 °С в минуту, далее до конца анализа температура без изменений;

-газ-носитель – азот;

- скорость потока газа через колонку – 1,50 мл/мин.;

-вспомогательные газы: водород, воздух;

-объем вводимой пробы – 1 мкл;

-время хроматограммы – 10 минут.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1 – Хроматограмма стандартного раствора дицикловерина гидрохлорида (10 мкг/ мл) в метаноле на колонке НР-5 (детектор ТИД)

     В данных условиях дицикловерина гидрохлорид элюируется в виде симметричного пика со временем удерживания – 7,7±0,1 мин. Для проверки специфичности предложенных условий анализировались экстракты из модельных смесей дицикловерина гидрохлорида и мочи (10 мкг/мл), а также экстракт холостой пробы мочи. Установлено, что в выбранных условиях наблюдается четкое разделение пика исследуемого вещества и пиков соэкстрактивных веществ (коэффициент разделения пика дицикловерина гидрохлорида и ближайшего пика на хроматограмме Rs=3,6).

   Для количественного определения дицикловерина в экстрактах из мочи предложен метод внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта выбран дифениламин, поскольку он хорошо разделяется с анализируемым веществом в разработанных условиях, имеет близкое время удерживания и не является объектом злоупотребления. Помимо этого дифениламин хорошо растворяется в метаноле и хлороформе, которые используются на различных этапах пробоподготовки объекта к анализу.

    Для построения калибровочного графика готовили модельные смеси мочи с содержанием дицикловерина от 1 до 25 мкг в пробе (10 мл). В каждую пробу добавляли 25 мкг дифениламина. Экстракты анализировали методом ГЖХ. Пример калибровочной хроматограммы и градуировочный график количественного определения дицикловерина приведены на рис. 2 и 3.

    Зависимость между концентрацией растворов и соотношением площадей хроматографических пиков дицикловерина и дифениламина описывается уравнением Sв-ва/Sвн.ст.=0,045c. Линейность градуировочного графика наблюдается во всем интервале выбранных концентраций (коэффициент корреляции составляет 0,999). Чувствительность метода – 1 нг во вводимой пробе (1 мкл).

Рис. 2 – Пример калибровочной  хроматограммы модельной смеси мочи, содержащей дицикловерина гидрохлорид и внутренний стандарт

 Рис. 3 – Градуировочный график количественного определения дицикловерина гидрохлорида методом внутреннего стандарта

Газовая хроматография с масс-селективным детектированием

Исследования проводились  на газовом хроматографе Agilent 7890A с масс-спектрометрическим детектором Agilent 5975С на капиллярной неполярной колонке НР-5МS. Ввод пробы (1 мкл) осуществлялся автоматически без деления потока газа-носителя. Масс-детектор работал в режиме сканирования спектров электронного удара при 70 эВ в интервале от 50 до 550 а.е.м.

      При разработке методики варьировали скорость потока газа-носителя, температурные режимы инжектора и хроматографической колонки. Предложены следующие условия анализа методом ГХ/МС:

- Скорость потока газа-носителя (гелий) – 1 мл/мин.

- Ввод пробы производится автоматически без деления потока газа-носителя.

-Температура инжектора – 250 °С.

-Температура интерфейса – 320 °С.

-Температурная программа колонки: начальная температура – 70 °С (выдержка 5 минут), повышение температуры со скоростью 10 °С/мин. до 320 °С с выдержкой при конечной температуре 8 минут.

-Время удерживания дицикловерина гидрохлорида составило 14,00±0,10 мин.

    Масс-спектр дицикловерина гидрохлорида приведен на рисунке 5. Характеристические ионы в масс-спектре дицикловерина гидрохлорида: 86, 99, 71, 83 m/z (данные приведены в порядке уменьшения m/z).

 

 

 

 

Рис. 5 – Масс-спектр дицикловерина гидрохлорида

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Изолирование  дицикловерина гидрохлорида из мочи

   Для разработки оптимального метода изолирования исследуемых веществ из мочи нами предварительно были изучены условия экстракции дицикловерина гидрохлорида органическими растворителями из водных растворов. Исследовано влияние на процесс экстракции аналитов следующих факторов: природы органического растворителя и pH буферного раствора.

    В качестве экстрагентов применяли следующие органические растворители: диэтиловый эфир, хлороформ, метиленхлорид и смеси хлороформ-изопропанол 9:1. Для создания определенного значения pH в растворе использовали универсальные буферные смеси Бриттона-Робинсона.

   Установлено, что при использовании любого из выбранных органических растворителей дицикловерина гидрохлорид имеет высокую степень экстракции (от 50% до 100%) в широком диапазоне рН (от 3 до 12), что может быть обусловлено высоким сродством исследуемого вещества к органической фазе (коэффициент распределения Log Pоктанол/вода равен 3,98).

     Путем эксперимента на модельных смесях анализируемых веществ и мочи было установлено, что максимальное извлечение дицикловерина достигается хлороформом при рН 2 (87,61%), тропикамида – хлороформом (86,35%) при рН 9 и смесью хлороформ-бутанол в соотношении 6:1 (71,60%).

 По результатам проведенных  исследований предложены следующие  методики изолирования дицикловерина гидрохлорида из мочи:

Методика изолирования дицикловерина гидрохлорида: 10 мл мочи помещают в стеклянный флакон с навинчивающейся крышкой вместимостью 30 мл. Мочу подкисляют до рН 2 по универсальному индикатору хлористоводородной кислотой разведенной и добавляют 5 мл хлороформа. Содержимое флакона взбалтывают в течение 5 минут на механическом встряхивателе при 150 об/мин. Затем смесь из флакона переносят в делительную воронку, оставляют на 2-3 минуты для расслоения и фильтруют органическую фазу через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом в сухой чистый пенициллиновый флакон. Экстракцию проводят дважды. Фильтр промывают 0,5 мл хлороформа, хлороформное извлечение выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1000 мкл метанола, центрифугируют при 10000 об/мин. в течение 5 минут и подвергают дальнейшему исследованию.

    Данная методика были апробированы на модельных смесях мочи с концентрацией анализируемых веществ – 1; 1,5; 2 и 5 мкг/мл. Результаты количественного определения веществ в биожидкости и метрологическая оценка результатов представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 – Результаты количественного  определения дицикловерина гидрохлорида в модельных смесях мочи методом ГЖХ

Концентрация дицикловерина гидрохлорида в модельной смеси, мкг/мл	Метрологические характеристики (n=5, t=2,78)
		S			Δх	Δ	ε	ε
1,0	83,48%	3,16	1,41		8,78	3,92	10,52	4,70
1,5	81,63%	3,10	1,38		8,62	3,85	10,56	4,72
2,0	83,86%	2,82	1,26		7,84	3,50	9,35	4,17
5,0	86,98%	2,51	1,12		6,98	3,12	8,02	3,59

 

    Предложенная методика изолирования позволяет выделить в зависимости от концентрации 81,63 – 86,98% дицикловерина гидрохлорида из 10 мл мочи (относительная ошибка определения 3,59 – 4,72).

  Предел обнаружения дицикловерина гидрохлорида в моче по данной методике составляет 0,05 мкг/мл. Предел количественного определения 0,1 мкг/мл.

Таблица 5 – Результаты количественного  определения тропикамида в модельных смесях мочи методом ВЭЖХ

Концентрация тропикамида в модельной смеси, мкг/мл	Метрологические характеристики (n=5, t=2,78)
			S	S		Δх		Δ	ε	ε
1,0		73,81%	3,31		1,48		9,20	4,11	12,46		5,57
1,5		75,25%	3,14		1,40	8,73		3,90	11,60		5,18
2,0		76,33%	3,01		1,34	8,37		3,74	10,97		4,90
5,0		78,13%	2,54		1,15	7,06		3,15	9,04		4,03

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Схемы химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида и тропикамида

На основании проведенных  экспериментальных исследований по разработке условий изолирования, обнаружения  и количественного определения  предложены следующие схемы химико-токсикологического анализа дицикловерина гидрохлорида в моче (рис. 12).

Комплекс разработанных  методик апробирован на экспертном материале, поступившем на исследование в ХТЛ Пермского краевого наркодиспансера.

Рис. 12 – Схема химико-токсикологического исследования мочи на наличие дицикловерина гидрохлорида

В исследованных реальных пробах мочи (5 образцов) содержание дицикловерина гидрохлорида варьировалось в диапазоне концентраций от 0,22 до 2,30 мкг/мл.