Флуориметрия

Оглавление

Введение

1.  Экспериментальная часть

1.1 Подбор оптимальных условий флуориметрирования

1.2 Разработка флуоресцентных методик

1.3 Поиск флуоресцентных реакций на салициловую к-ту

1.4 Поиск флуоресцентных реакций на кверцетин

1.5 Поиск флуоресцентных реакций на 2-амино-4-окси-6- птеридинкарбоновую к-ту

1.6 Флуориметрическое определение салициловой кислоты в лекарственных формах ацетилсалициловой к-ты

1.7 Флуориметрическое определение кверцетина в лекарственных формах рутина

1.8  Флуориметрическое определение 2-амино-4окси-6-птеридинкарбоновой к-ты в лекарственных формах фолиевой к-ты

Литература

 

Введение

         Вопросы стандартизации и контроля качества лекарственных средств продолжают оставаться актуальными направлениями развития фармацевтического анализа. Это обусловлено, в том числе, общим увеличением числа лекарственных средств, введением в качестве лекарственных, новых биологически активных веществ, принадлежащих к различным классам природных и синтетических соединений.

     Проблема  ухудшения качества продукции отечественного фармацевтического рынка неоднократно обсуждался на заседаниях правительства  РФ и связывается специалистами  с тремя основными факторами:

1. Нелегальный ввоз лекарственных препаратов и биологически активных добавок из-за рубежа.
2. Несовершенство законодательной базы регулирующей оборот лекарственных средств на территории страны.
3. Высокие технические возможности нелегального производства препаратов - фальсификатов и ограниченные аналитические возможности выявления подделки лекарственных средств.

     Поэтому совершенствование способов контроля качества при производстве и особенно количественное определение при  клиническом использовании может  считаться одной из наиболее важных задач современной клинической  фармации.

     Разработка  методик контроля качества лекарственных  средств базируется на использовании  новейших аналитических методов, таких  как ВЭЖХ и ГЖХ, ИК и ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия. Не теряют своей  значимости ТСХ, спектрофотометрия.[1] Однако условием испытания подлинности остается идентификация ионов и функциональных групп органических веществ, входящих в структуру молекул, посредством их химического анализа. Химия развивается столь быстро, что даже при наличии экспрессных инструментальных, химические методы не только сохраняют свое значение, но и продолжают развиваться.

     Знание  и даже предположение химической структуры вещества позволяет оценить  его химические свойства и разработать  методики качественного и количественного  анализа. В ряде случаев именно специфические  реакции на функциональные группы позволяют  селективно проводить определение  сложных систем. Реакции получения  производных часто положены в  основу физико-химических методик обнаружения  и количественного определения  лекарственных средств, а сочетание  инструментальных и химических методов  позволяет решить разнообразные  задачи. [6]

     Наша  работа посвящена решению актуальной фармацевтической задачи - разработке методик качественного и количественного  определения примесей на примере  флуоресцентного анализа лекарственных  средств

     Преимущества, которые дает флуориметрия в анализе  лекарственных средств в различных  объектах, способствовали введению этого  метода в перечень фармакопейных.[5]

     В функциональном анализе фармацевтических соединений предполагается обычно, что  молекулу органического соединения можно рассматривать как сумму  практически независимых функциональных групп и, следовательно, принимается, что физические и химические свойства соединения определяются свойствами этих функциональных групп. При проведении идентификации сложных молекул, несомненно, следует учитывать взаимное влияние функциональных групп, которое  может вызвать неожиданное изменение  свойств этих групп, а также отклонения наблюдаемых свойств от теоретически ожидаемых.

     Методы  флуоресцентного анализа имеют  важное самостоятельное значение особенно в промышленности при получении  фармацевтических препаратов, так как  проведение функционального анализа - важная и часто необходимая стадия при определении качественного  состава сложных смесей.

     Учитывая  вышесказанное, нами показан поиск  теоретически обоснованного подхода  к разработке реакций флуоресцентного  определения. В основу подхода была положена идея получения конкретного  производного, флуоресцирующего в видимой  области спектра. Результатом исследования стали флуоресцентные реакции и  разработанные на их основе методики обнаружения и количественного  определения примесей в лекарственных  препаратах.

     Абсолютно чистое вещество можно представить  только теоретически. Поэтому и определения  его возможны только теоретические. Термодинамика считает вещество чистым, если оно ведет себя в  многофазной системе как один независимый компонент и при  всех операциях имеет химический потенциал. Кинетика считает вещество чистым, если оно состоит из молекул  одного типа. В действительности абсолютно  чистых веществ нет и быть не может, могут быть только вещества, более  или менее приближающиеся к абсолютно  чистым. Практика считает вещество достаточно чистым, если оно не содержит примесей такого рода и в таких  количествах, которые мешают использованию  этого вещества для определенной цели.

     Чистота - одно из основных требований, предъявляемых  к лекарственным препаратам, обуславливающим  как возможность получения чистого  соединения, так и его стабильность. Это требование непрерывно растет по отношению к лекарственным препаратам. Содержание основного вещества в  настоящее время пока составляет не более 97-98%, поэтому как методы очистки, так и методы контроля очень  важны при оценке качества лекарственных  средств. 

 

      1.Экспериментальная часть

     За  последние годы практическая медицина обогатилась большим количеством  новых эффективных лекарственных  средств. Увеличение арсенала лекарственных  препаратов сопровождается одновременным  развитием новых методов их качественного  и количественного анализа. Методы, эффективность которых всеми  признана, вносятся в Государственную  Фармакопею и становятся официальными. Одним из таких методов является флуориметрия (люминесцентный анализ).

     Метод люминесцентного анализа, характеризуется  исключительно высокой чувствительностью, дает возможность определить сотые, тысячные и десятитысячные доли микрограмма  вещества.

     Практически все органические соединения способны не только избирательно поглощать, но и излучать полученную энергию. Флуориметрия, как наиболее простой из эмиссионных  методов используется незаслуженно ограниченно. Далеко не все лекарственные  соединения обладают собственной флуоресценцией в видимой области спектра, на наблюдении которой чаще всего и  основываются методики. Как и фотометрический  анализ, флуориметрия должна быть иметь  набор реакций групповых и  специфичных, методики обнаружения  и количественного определения  в различных объектах. Поэтому, в  целях развития и совершенствования  метода, необходим поиск химических реакций, приводящих к образованию  флуоресцирующих в видимой области  производных.

     Возможности флуоресцентного метода

     Флуориметрия - один из эмиссионных аналитических  методов и относится к фотометрическим  методам. Позволяет обнаруживать микро- и нанограммовые количества анализируемых  веществ с достаточной точностью, что используется в анализе примесей. Наличие двух характерных максимумов (в спектре возбуждения и в  спектре излучения флуоресценции) увеличивает избирательность определения. Изменение цвета и выхода флуоресценции  при смене растворителя и рН используется для идентификации и исследования структурных особенностей молекул.

     Во  флуоресцентном анализе растворов  обычно используются следующие свойства:

     а) способность к флуоресценции самого соединения в зависимости от свойств растворителя ( рН, диэлектрическая проницаемость);

     б) возникновение или изменение флуоресцентных свойств в присутствии катионов металлов (хелатообразование);

     в) образование флуоресцирующих ассоциатов;

     г) возникновение или изменении флуоресценции флуорогенного метчика при присоединении к нему определяемого соединения;

     д) возникновение флуоресценции в процессе взаимодействия исследуемого соединения и реагента в результате образования нового соединения с высоко поглощающей устойчивой структурой;

     е) возникновение флуоресценции в результате присоединения к исследуемому соединению "флуорофора" - группировки, повышающей поглощающую и излучающую способность;

     ж) возникновение флуоресценции в результате электронных перегруппировок внутри молекулы без изменения ее формулы (окислительно-восстановительные процессы);

     з) «тушение» собственной флуоресценции одного вещества в присутствии другого.

     Современная аналитическая химия располагает  широким выбором методик проведения флуоресцентного анализа, применяемых  в различных областях медицинской  науки для контроля содержания лекарственных  веществ в различных объектах. Тем не менее, флуоресцентный метод  имеет ряд недостатков, основными  из которых можно считать низкий порог концентрационного тушения  и необходимость использования  стандартных образцов при проведении анализа флуоресцирующих соединений. Эти недостатки существенно ограничивают использование флуориметрии в фармацевтической и биофармацевтической практике, не позволяя проводить флуоресцентные определения в растворах веществ, имеющих концентрацию более 15-20 мкг/мл. Необходимость разбавления анализируемых проб приводит к увеличению систематических ошибок анализа и заметно снижает экспрессность методик.[10]

     В работах, посвященных проблеме возникновения  тушения при флуоресцентных исследованиях, как правило, приводится классификация  различных видов тушения, их механизмы  и условия проведения флуориметрических  определений, которые позволяют  избежать процесса тушения. Наиболее приемлемы  две основных теории возникновения  концентрационного тушения.

     Первая  теория показывает, что при увеличении количества частиц анализируемого вещества происходит увеличение взаимодействия между этими частицами и, соответственно, вероятность безизлучательных энергетических переходов. Такое изменение в  энергетике молекул уменьшает квантовый  выход флуоресценции.

     В основу второй теории положен миграционный механизм концентрационного тушения, весьма важным условием, которого является значительное перекрывание спектров поглощения и излучения анализируемого вещества. Согласно этой теории возможна индукционно  резонансная передача энергии, т.е. процесс безизлучательной передачи энергии облегчается тем, что  строение высшего Ьо энергетического  уровня возбужденной молекулы, близко к строению низшего Si уровня излучающей молекулы. [2,3,4,7]

     Хотя  явление концентрационного тушения  основательно изучено и описано  различными исследователями, подходы  и направления к преодолению  порога концентрационного тушения  сводятся, как правило, к разбавлению  растворов или измерению флуоресценции  с поверхности анализируемой  пробы. Новый подход к решению  этой проблемы состоит в контролируемом изменении интенсивности возбуждающего светового потока или изменении толщины поглощающего/излучающего слоя жидкости.[56]

     Поглощение  света, безусловно, является необходимым  условием флуоресценции, но в тех  случаях, когда поглощение раствора слишком высоко, световой поток не проходит через него и не может  служить источником возбуждения. Как  известно, при высоких концентрациях  участки раствора, расположенные  ближе к источнику возбуждения, поглощают большее количество света, чем дальше расположенные. Интенсивность  освещения раствора и, соответственно, излучение прогрессивно убывают  по мере удаления от источника (внутреннее экранирование).

     Процесс флуоресценции веществ подчиняется  законам светопоглощения, как и  все оптические методы анализа: интенсивность  проходящего через раствор вещества светового потока уменьшается согласно закону Бера - Ламберта: I = I₀ -kcl (1),

     где: I - интенсивность светового потока, проходящего через раствор;

     Iо- интенсивность падающего света;

     К - коэффициент поглощения раствора;

     С - концентрация вещества;

     I - длина пути светового потока в поглощающем растворе вещества.