Хроматографический бумажный метод

Бумажная хроматография — метод анализа состава исследуемого образца. Был открыт в 1944 году Констоном, Гордоном, Мартином и Сенджем, которые использовали его для анализа смесей аминокислот. Мартин и Сендж впоследствии были удостоены Нобелевской премии за открытие распределительной хроматографии. В последующие 10 лет этот метод получил огромное распространение, но с 1952 года бумажную хроматографию начал вытеснять новый метод тонкослойной хроматографии (являющийся по сути обобщением бумажной). Последний оказался эффективнее благодаря большей скорости эксперимента, пригодности для препаративных целей и более широким возможностям обнаружения. Поэтому сейчас бумажная хроматография уже практически не применяются, а методы её давно не совершенствуются.

Классификация.Бумажной хроматографию, как и хроматографию вообще, можно разделить на распределительную, адсорбционную и ионообменную, а также на препаративную и аналитическую. В распределительной бумажной хроматографии можно выделить нормальную и обращённо-фазную хроматографию. В последнем случае (в отличие от нормального подхода) неподвижная фаза более липофильна, чем подвижная. Этот метод применяется для разделения липофильных веществ.

Носитель.При распределительной БХ носителем неподвижной фазы является целлюлоза в виде листов бумаги, которая даже в высушенном виде содержит значительное количество связанной воды. Распределение происходит между связанной водой и растворителем, хотя присутствуют и адсорбционные эффекты. Для БХ применяется качественная бумага, которая может быть модифицирована в соответствии с поставленными задачами. Также используется бумага из стекловолокна, которая устойчивы к коррозионно-активным реагентам и обладает низкой адсорбционной способностью.

Один из наиболее ранних способов модифицирования хроматографической бумаги — ацетилирование. Бумага, полученная таким образом, используется для обращённо-фазной хроматографии. Позднее было обнаружено, что эта бумага пригодна и для разделения рецемических смесей, так как ацетилцеллюлоза сама является хиральным веществом и потому энантиомеры перемещаются по ней с различной скоростью. Как носители неподвижной липофильной фазы применяются также силиконы.

Методика.В бумажной хроматографии вещества различаются по их относительному положению на бумаге после того, как растворитель пройдёт определённое расстояние. Небольшое количество раствора смеси (10-20мкл), которую нужно разделить, наносят в отмеченную точку на бумаге и высушивают. Полученное пятно называют стартовым. Затем бумагу помещают в герметичную камеру и один её конец погружают в растворитель, который является подвижной фазой. Под действием капиллярных сил растворитель движется по бумаге, растворяя и увлекая за собой компоненты образца. До начала движения образец должен полностью раствориться, поэтому скорость растворения компонентов в подвижной фазе является одним из факторов, определяющих эффективность разделения. После того, как растворитель пройдёт определённое расстояние, лист вынимают и сушат. Затем образовавшиеся пятна, которые могут быть как видимые, так и невидимые, обнаруживают и отмечают.

Отношение расстояния, пройденного  пятном, к расстоянию, пройденному растворителем стандартно обозначается Rf. Эта величина зависит от вещества, бумаги и природы растворителя. Бумажные хроматограммы могут проявляться в восходящем, нисходящем и горизонтальном токе растворителя, что слабо отражается на их качестве. Поэтому выбор определяется другими факторами: по сравнению с восходящей хроматографией нисходящая имеет определённые преимущества. А именно, она требует меньше времени и не ограничена по длине пробега. С другой стороны, для нисходящей БХ играет важную роль тщательность подготовки камеры, так как загрязнение или плохой контакт бумаги в месте соприкосновения со стенкой лодочки может приводить к неоднородному току и, как следствие, образованию полос.

Буш и Кроушоу предложили методику скоростной БХ. Эта методика предусматривает применение более узких камер, горизонтальное хроматографирование, насыщение атмосферы камеры парами растворяющей системы, а главное — предварительную пропитку бумаги водной неподвижной фазой. Нередко весьма эффективна оказывается т. н. двумерная БХ, которая заключается в том, что после проведения хроматографии в одном направлении бумагу высушивают и повторно хроматографируют с другим растворителем под прямым углом к первоначальному направлению. При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе. Обнаружение.Пятна на хроматограммах могут быть обнаружены по цвету, флуоресценции, с помощью химических реакций, для чего бумагу опрыскивают или погружают в различные реагенты, или же по радиоактивности. Идентификацию проводят обычно путём сравнения с образцами с известными величинами Rf или после элюирования, которое сводится к вырезанию зоны, содержащей пятно, и последующему промыванию её соответствующим растворителем.

 Пептидные  карты.Важной проблемой в молекулярной биологии является идентификация выделенного белка или установление изменения аминокислотного состава в мутантном белке. Для решения этих задач была разработана^[кем?] техника «отпечатков пальцев». Если белок подвергнуть расщеплению в стандартных условиях с использованием различных протеиназ (ферментов, специфически разрывающих определённые пептидные связи), в качестве продуктов образуются небольшие пептиды. Число и типы получающихся пептидов зависят от строения данного белка и вида использованной протеиназы. Пептиды можно затем разделить при помощи двумерной хроматографии на бумаге, получая при этом распределение пятен, которое практически никогда не совпадает для различных белков. Такая пептидная карта и называется «отпечатками пальцев». Этот метод находит несколько важных приложений в молекулярной биологии, среди которых можно отметить следующие: доказательство того, что один белок является продуктом расщепления другого; идентификация аминокислот, вводимых с помощью различных супрессорных тРНК; идентификация замен оснований в результате частичного мутагенеза.

КОЛЛЕДЖ ЭКОНОМИКИ  БИЗНЕСА И ПРАВА ПРИ КЭУК

По предмету: Аналитическая  химия 

На тему: Хроматографический бумажный метод

Выполнила: Кыдырман.М

Проверила: Кулова Б.Б

КАРАГАНДА 2013