Роль кремния в силикатных имплантационных материалах

Б.И. Белецкий,  Н.В. Свентская

     Введение

     Современные методы восстановительной и заместительной хирургии направлены не на удаление повреждённого органа, а на сохранение и восстановление его биомеханических свойств и структурной целостности. В зависимости от интенсивности протекания биологических и физико-химичемких процессов на контактной поверхности “материал – кость”, выделяют биоинертные, биоактивные и биодеградируемые имплантационные материалы. Многочисленными исследованиями установлено, что только биоактивные и биодеградируемые матрицы способны индуцировать регенеративные процессы в тканях воздействием на клеточном уровне, т.е. стимулировать адгезию, закрепление клеток, способствовать формированию их микроокружения, активизировать их жизнедеятельность и синтетическую способность.

       Биологическая роль кальций-фосфатных имплантационных материалов в процессах образования костных структур выявлена достаточно полно. Однако, кремнию, который входит в состав биостёкол, биокерамики, биокомпозиционных материалов, стеклоиономерных цементов, кремний-структурированных фосфатов кальция Si-ГА и Si-ТКФ уделяется недостаточно внимания. В настоящей работе предпринята попытка рассмотреть процессы, протекающие на границе контакта “ имплантат-кость”, с участием  кислородных соединений кремния.

     Роль  кремния в процессах  формирования скелетных  тканей

     В живых системах содержание кремния  и его роль неодинакова. Например, В.И. Вернадский по этому признаку разделил живые существа на три категории: так называемые кремнеорганизмы, в которых более 10% (здесь и далее – массовые %) кремния; богатые кремнием существа, в которых его не менее 1-2%, и обычные организмы, содержащие лишь 0,1-0,001% кремния [1]. Для организма человека кремний является микроэлементом  и измеряется в единицах ppm (parts per million – миллионная доля). Однако, понимание биологических процессов, в которых участвует кремний, позволяет не только разрабатывать имплантационные материалы нового поколения, но так же и прогнозировать реакцию организма на их подсадку.

     В организмах животных и птиц кремний  присутствует в соединительной ткани, шерсти, ногтевых пластинах, перьях, коже, сухожилиях, мускулах и костях. В  организме человека кремний изменяет своё содержание от 0,6 ppm для сыворотки крови, до 10 ppm  в печени, почках, до 41 ppm  в мускульной ткани и 57 ppm в ткани лёгких, 100 ppm в костях и 200–600 ppm в хрящевой ткани, значительные количества кремния обнаружено в пуповине [2, 3]. Многочисленные исследования показали, что кремний связан с полисахаридной матрицей и входит в структуру гликозаминогликанов,  полиуронидов, гиалуроновой кислоты, хондротинсульфата, дерматинсульфата и гепаринсульфата. Высокие концентрации кремния наблюдают в межклеточных матричных компонентах, где кремний выполняет роль биологического связующего агента,  способствующего поддержанию архитектоники и упругости соединительных  тканей [3].

     Впервые роль кремния в физиологических  процессах  формирования скелетных тканей изучила Е. Carlisle [4]. Она исследовала влияние диетического, кремнёвого  питания на рост и развитие костных и хрящевых тканей молодых цыплят. У подопытных с кремний-дефицитным питанием наблюдали значительное снижение веса,  деформацию костей и гребешка, хрящевые ткани характеризовались низким содержанием коллагена и неколлагеновых протеинов, в то время, как у цыплят, получавших в питании  дополнительно 100 мг/г метасиликата кальция, наблюдали нормальное развитие костных и хрящевых тканей. В аналогичных исследованиях на кроликах, Schwartz and Milne так же устанавливают влияние диетического кремнёвого рациона: у животных с дефицитным питанием были деформированы скуловые кости и эмаль зубных тканей, наблюдали низкое содержание воды в костной ткани и гликозаминогликан [5]. Carlisle  Е. установила, что кремний жизненно необходим для нормального роста и развития скелетных тканей. На стадии формирования органического предшественника кости обнаруживают значительные количества кремния, который связывает синтезируемые   коллагеновые волокна в единую матрицу, позже, когда происходит минерализация сформированного органического матрикса, кремний вытесняется кальцием, и его содержание в кости определяется минимальными количествами. Таким образом, кремний играет роль “переходного” элемента, необходимого для стабилизации органического матрикса  хрящевых и костных тканей.

     Оценка  биологической активности кремний-содержащих имплантационных  материалов в культуре остеогенных клеток.

     Исследования  in vitro с использованием культур остеогенных клеток позволяют прогнозировать реакцию ткани в условиях in vivo на подсадку разрабатываемых имплантационных материалов. Изучение поведения остеогенных клеток на кальций-фосфатных матрицах, модифицированных ионами  Na+, K+ и с введённым в структуру SiO₂, и сравнение полученных результатов с - α-ТКФ,  показали, что прикрепление остеогенных клеток, синтез коллагена и экспрессия остеогенных маркеров на поверхности CaNaPO₄ и CaNaPO₄ с 9% (вес.)  SiO₂ было наибольшим, поэтому данные субстраты способствуют лучшей активации и дифференциации остеогенных клеток в сравнении с исходным α-ТКФ [6]. В работе [7] так же проводили сравнительное исследование влияния химического состава субстратов на клеточную линию остеобластов; в качестве матриц для культивирования использовали: продукты растворения биоактивного стекла BG60S (состав, масс.: SiO₂ - 60%, CaO – 35%, P₂O₅ - 5%); бифазную кальций-фосфатную керамику и контроль. Было установлено, что в присутствии продуктов растворения биоактивного стекла  увеличивается пролиферация клеток на 35%, их жизнеспособность, синтез клетками коллагена повышается  на 25% в сравнении с двухфазной кальций-фосфатной керамикой. Установлено, что значительное увеличение активности клеток в присутствии  продуктов резорбции  BG60S  связано с растворением кремнёвой составляющей биоактивного стекла; выход ионов кальция из структуры материала не оказывал влияния ни на пролиферацию клеток, ни на их синтетическую способность. Авторы [3] так же отмечали значительное увеличение пролиферации, дифференциации, секреции коллагена и жизненности остеобластов при введение в культуру остеогенных клеток крыс в условиях  in vitro продукта растворения Bioglass (состав, масс.: SiO₂ - 45%, CaO – 24,5%, Na₂O – 24,5% P₂O₅ - 6%)   или псевдоволластонта α-CaSiO₃.

     Многочисленные  исследования по культивированию остеогенных клеток  на различных субстратах показали, что прикрепление клеток, их  пролиферация, дифференциация, синтез коллагена и остеогенных маркеров происходит значительно активнее на тех материалах, которые содержат в своём составе соединения кремния. В работе [7] изучали морфологию остеобластов, культивированных в присутствии  BG60S. Было обнаружено образование в клетках большого числа вакуолей, жидкое содержимое которых на 75% содержало кремний. Формирование значительного числа вакуолей в клетке обычно ведёт к апоптозу, однако в данном случае, наоборот происходило повышение жизнеспособности, пролиферативной активности клеток, синтеза коллагеновых волокон. Подобное поведение может быть объяснено, с одной стороны, использованием  кремния в качестве “связующего” агента в процессе синтеза коллагеновых волокон за счёт реакций конденсации между коллоидным кремнием и фибриллами коллагена. С другой стороны, дополнительными адгезионными взаимодействиями   рецепторов клетки и силикагелем, формирующимся на поверхности субстрата при воздействии физиологической среды.

     Значительный  интерес у материаловедов вызывают имплантационные материалы нового поколения  –  кремний-структурированные  фосфаты кальция -  Si-ГА и Si-ТКФ. Сравнительные исследования кальцийфосфатных материалов, содержащих в своей структуре химически связанный кремний Si-ГА и Si-ТКФ с исходными ГА и ТКФ, показывают, что введение кремния вызывает значительно более высокий биологический отклик, что может быть связано с   Si-индуцирущим изменением свойств материала, а так же важной роли кремния в физиологических процессах роста и перестройки костной и хрящевой ткани.

     При введении кремния (в пределах нескольких вес. %) в кристаллическую структуру ГА (конечный продукт описывается формулой Ca₁₀²⁺(PO₄^3-)_6-х(SiO₄^4-)_х(OH^-)_2-х) изменяется эффективный заряд поверхности материла (характеризуется более высокими значениями электроотрицательности), что связано со специфическим расположением силикат-ионов относительно фосфат-ионов в кристаллической решётке Si-ГА. В испытаниях Si-ГА и эталонного ГА  в условиях in vivo было показано, что на поверхности образцов Si-ГА в значительно более короткие сроки происходит адсорбция протеинов, прикрепление клеток остеобластов, специфические клеточные реакции (синтез коллагена I типа, активация щелочной фосфатазы) и, соответственно, минерализация молодого костного матрикса [3,8].

     В исследованиях Mastroigacoma M. и соавт. [9], проводимых в период 1 и 2 года, с использованием имплантатов Skelite (состав, масс.: 67% Si-ТКФ и 33% ГА/β-ТКФ) было выявлено, что в период 3 мес – 1 год происходит активное формирование молодых  костных структур в открытых порах имплантата и резорбция материала. Через  1 год после имплантации, количество нерезорбировавшей матрицы соответствует 10-20 % от общего объёма, а через 2 года матрица полностью резорбирует и замещается сформировавшейся, высокоминерализованной костной тканью. В случае модифицирования имплантационного материала Skelite стромальными костными клетками, было показано, что  уже на сроке 4 месяцев имплантаты модифицированные   стромальными костными клетками способствуют формированию минерализованной костной ткани и подвергаются значительной резорбции, в сравнении с эталонным Skelite.

     Кремний-структурированные фосфаты кальция Si-ГА и Si-ТКФ и имплантационные материалы на их основе имеют ряд преимуществ над исходными, немодифицированными ГА и ТКФ: более высокую степенью резорбции, что связано с нарушением кристаллической структуры – появлению дефектов и вакансий; специфическую, более электороотрицательную поверхность, содержащую гидрофильные ≡Si-OH группировки, с которыми легко вступают во взаимодействия полярные группы органических соединений, облегчая прикрепление клеток и способствуя формированию большего количества связей имплантат - кость. Кроме того, кремний активизирует деятельность клеток – остеобластов и остеокластов, что в значительно большей степени ускоряет регенеративные процессы в тканях.

     Растворимость биоактивных силикатных стёкол в условиях  in vitro и in vivo

     Многочисленными исследованиями установлено, что растворимость  биоактивных силикатных стёкол в  условиях  in vitro и in vivo, а так же их связывание со скелетными и мягкими тканями определяется химическим составом стекла и контактной среды.

     Hench L.L. [10] в системе Na₂O-CaO-P₂O₅-SiO₂ выделил пять областей составов различной биоактивности: нетехничные; абсолютно инертные; биоактивные стёкла, связывающиеся с костью; биоактивные стёкла, связывающиеся с костью и  коллагеновыми волокнами мягких  тканей; биодеградируемые стёкла,  резорбция которых начинается уже в первые 10-30 дней.

     В работах Andersson O.H., Karlsson K.H. [11, 12], изучено поведение биоактивных стёкол системы SiO₂-Na₂O-CaO-P₂O₅-Al₂O₃-B₂O₃ в условиях  in vivo, авторами [13] в условиях  in vitro  исследованы стёкла системы SiO₂-Na₂O-CaO-P₂O₅- K₂O- Al₂O₃-B₂O₃. Во всех работах отмечается, что для различных составов биоактивных кремний-содержащих стёкол  механизм протекания поверхностных реакций и формирования связи имплантат–кость одинаков. Во всех случаях при воздействии физиологических сред на имплантат, как показали концентрационные профили “имплантат-кость” [11, 12, 13], на его поверхности формируется гель кремнёвой кислоты. В то же время, содержание в поверхностном реакционном слое ионов натрия, кальция, алюминии, фосфора минимальное. Впоследствии, на поверхности кремнёвого геля формируются  кальцийфосфатные слои различной “мощности”. Образование силикатного геля описывается реакцией:

                    ≡Si-ONa + R-COOH                    ≡Si-OH + R-COONa

     В зависимости от типа биоактивности  стекла (химически стойкое, биоактивное, биодеградируемое) изменяется как “мощность” образующегося геля кремнёвой кислоты  так и протекание последующих  реакций связывания. В случае химически  стойкого стекла толщина образовавшегося слоя силикагеля незначительна, на поверхности же биодеградируемых стёкол процессы растворения идут гораздо активней и глубже, формируя “мощный” слой кремнезёмного геля. Образовавшиеся многочисленные ≡Si-OH полярные группы служат адгезивными островками, к которым прикрепляются клетки остеобластов путём реакции конденсации молекулы белка и силанольной группировки.  Избыточные силанольные группировки подвергаются  дальнейшему гидролизу, что приводит к образованию высокогидратированного коллоидного геля кремнёвой кислоты, растворимого в среде организма.

     Степень гидратации поверхности биоактивных  стёкол различна и зависит от конкретного  состава: высококремнезёмистые стёкла образуют прочный, непрерывный кремний-кислородный каркас и слабо подвергаются гидролизу. Так же слабо гидролизуются стёкла с низким содержанием кремнёвой составляющей и присутствующими в составе оксидами CaO, P₂O₅, Al₂O₃, B₂O₃, стабилизирующими кремний-кислородный каркас. Ингибируют процессы связывания добавки Al₂O₃, Ta₂O₅, Sb₂O₅, TiO₂, ZrO₂ [14, 15]. Напротив, увеличение содержания Na₂O за счёт CaO при постоянном уровне оксидов кремния и фосфора приводит к повышению растворимости, формированию “мощного” силикагеля, и постепенной деградации имплантированного стекла в среде организма.

     Механизм  связывания костной ткани с имплантационным  материалом аналогичен  механизму  естественного ремоделирования кости [16]. На начальном этапе происходит резорбция материала, осуществляемая остеокластами, которые прикрепляясь к поверхности материала, секретируют и выделяют в резорбирующую зону органические кислоты (лимонную, молочную, янтарную или угольную). Растворимые продукты деградации поступают в кровеносную систему и удаляются из организма. Резорбция может продолжаться у взрослого человека до 6 недель.  Далее наступает фаза реверсии, 1-2 недели, которая характеризуется переходом от процессов резорбции к формированию костной ткани за счёт сопряжения деятельности остеокластов и остеобластов. Фаза формирования остеогенеза начинается с локальной дифференциации преостеобластов в остеобласты и их миграции в область резорбционной лакуны. Преостеобласты располагаются в остеогенной надкостнице, поэтому, имплантационный материал при хирургических реакциях стараются покрыть надкостницей. Прикрепление клетки остеобласта осуществляется рецепторами белковых молекул клеточной мембраны. Благодаря высокой синтетической и секреторной активности остеобластов лакуна постепенно заполняется органическим межклеточным веществом (откладывается со скоростью 2-3 мкм/сут.),  и в дальнейшем, спустя 5-15 суток, начинается минерализация, средняя продолжительность процесса составляет 20 недель. Впоследствии активные остеобласты утрачивают способность к секреции и минерализации костного матрикса и превращаются в неактивные остеобласты.