Анализ белка

АНАЛИЗ  БЕЛКА

Одним из важнейших  показателей качества продукции, определяющим ее пищевую ценность, является содержания белка. Классическим способом определения  белка является метод, разработанный  еще в 1883 году датским химиком  Иоганном Кьельдалем, который в последствии был назван его именем. Это очень трудоемкий и продолжительный анализ, и потому в современной лабораторной практике метод Кьельдаля часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка, в том числе, с использованием дорогостоящих программно-аппаратных комплексов. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа сырья и готовой продукции. По этой причине аппараты для определения белка по методу Кьельдаля есть практически в каждой лаборатории по анализу пищевой продукции, а альтернативные методики применятся только как вспомогательные при очень большом количестве ежедневных анализов. Для предприятия, только начинающего становление своей лаборатории, безусловно, предпочтительным является именно метод Кьельдаля.

МЕТОД КЬЕЛЬДАЛЯ  И РЕКОМЕНДУЕМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 120-летнюю историю, до сих пор не найдено достойной альтернативы? Причиной тому - высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые в последующем и могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: отбор и подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время фактически стали стандартом де-факто и практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

Этап 1. Отбор  и подготовка проб

Необходимое условие  получения точных результатов анализа  по Кьельдалю - тщательная подготовка образцов. Процедура подготовки проб должна обеспечивать гомогенизацию образца, т. к. размер частиц в анализируемых пробах не должен превышать 1 мм. Однородность образца повышает воспроизводимость метода, а также позволяет уменьшить объём пробы. Обычно при использовании частиц малых размеров повышается скорость озоления. Для измельчения мягких образцов (таких как субстрат или сами грибы) рекомендуется использование специальных лабораторных мельниц, но чаще всего бывает достаточно обычной кофемолки. Взвешивание образцов для последующего анализа по Къельдалю должно проводиться на аналитических весах с точностью до 0,1 мг. Важно знать влажность образца и всегда анализировать либо предварительно высушенные образцы, либо образцы с точно установленным содержанием влаги. Для определения содержания влаги рекомендуется использовать термогравиметрические анализаторы, имеющие погрешность на уровне 0.05-0.1%.

Этап 2. Мокрое озоление

Самым трудоемким и  продолжительным этапом в методе Кьельдаля является стадия мокрого озоления, в результате которого происходит полное "сжигание" образца в серной кислоте. Однако использовать для озоления чистую серную кислоту нецелесообразно из-за низкой скорости протекания процесса. Скорость озоления и разрушения образца зависят не только от свойств кислоты, но и от температуры обработки. Чем выше температура, тем меньше времени уходит на разложение. При использовании чистой серной кислоты температура озоления ограничивается, в основном, её точкой кипения (338°С), в то время как для полного разложения необходима более высокая температуры. Скорость мокрого озоления можно значительно увеличить за счет добавления солей и катализаторов. В классическом приборе Кьельдаля на каждый грамм образца обычно необходимо 25 мл кислоты и несколько часов для проведения разложения, в то время как, например, в блочных термореаторах, благодаря повышенной температуре разложения (420°С) и оптимизации процесса термообработки, для разложения 1 грамма вещества требуется в среднем 30 минут и лишь 10 мл кислоты. Термореактор позволяет не только снизить расход серной кислоты, но и уменьшить расход гидроксида натрия, используемого для последующей нейтрализации разложившегося образца. Основной эксплуатационной проблемой для данной стадии анализа является выделение большого количества ядовитых паров диоксида и триоксида серы. Для сбора и нейтрализации вредных выбросов рекомендуется использовать специальный поглотитель,и вакуумный насос.

Этап 3. Отгонка  с паром

Полученный после  стадии разложения прозрачный раствор  не годится для непосредственного  определения в нем аммонийного  азота из большого содержания мешающих компонентов. Для отделения аммонийного  азота он переводится в аммиачную  форму (добавлением щелочи) и отгоняется с паром на специальных приборах, называемых дистилляторами. Дистилляторы могут также использоваться для  отгонки аммонийного азота непосредственно  из образцов без их предварительного разложения, что позволяет выделить содержание аммонийного азота из общего азота по Кьельдалю.

Этап 4. Определения  содержания аммонийного азота

Результаты по определению  белка принято представлять в  мг/л аммонийного азота, поэтому  метод определения белка по Кьельдалю (что более распространено в пищевой промышленности) часто еще называют методом определения общего азота по Кьельдалю (используется, например, в экологическом анализе). Пересчет на содержание белка осуществляется по известному коэффициенту, который в общем случае равен 6.25, но может несколько отличаться для различных типов белка. Перегоняемый с паром аммиак собирается в колбе, в которую предварительно помещают раствор борной или серной кислоты с известной нормальностью. Полученный чистый раствор бората или сульфата аммония может быть легко оттитрован прямым или обратным методом. Если ежедневно производится анализ небольшого количество проб, то можно довольствоваться обычным бюреточным титрованием, но для титрования большого количества проб и для повышения точности результатов рекомендуется использовать автоматические титраторы. Хорошей альтернативой титриметрии может стать фотометрическое определение аммонийного азота при помощи готовых реактивов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Не рассматривались  другие методики определения белка, поскольку все они вторичны и  требуют калибровки по методу Кьельдаля. Несмотря на кажущуюся сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю, использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала.