Биосенсоры. Их настоящее и будущее

Этот принцип был продемонстрирован, в частности, при разработке L-цистеиново-го биосенсора с использованием огуречных листьев и аммиачного датчика [45]. В листьях огурца содержится фермент L-цистеиндесульфгидролаза, катализирующий реакцию

Таким образом, в цистеиновых сенсорах можно использовать электроды, чувствительные либо к NH3, либо к H2S, хотя из химических соображений первые предпочтительнее.

Методика изготовления цистеинового биосенсора довольно проста. Огурцы (Cucumis saturis) выращивают из семени в почве для рассады. По мере необходимости отрываю! зрелые листья и вымачивают их в воде в течение 45 мин. При вымачивании кутикула размягчается и легко удаляется, обнажая биохимически активный эпидермис. Эта процедура необходима, так как субстрат, L-цистеин, с трудом диффундирует через восковый слой кутикулы. Затем из листа вырезают диск нужного размера, помещают его на торец газового датчика и закрепляют диализной мембраной.

В фосфатном буферном растворе с  рН 7,6 электродная функция такого биосенсора характеризуется наклоном около 35 мВ/рС в диапазоне от 10"3 до 10"5 М. Такой относительно низкий наклон градуировочной кривой, наряду с довольно большим временем отклика, свидетельствует о необходимости дальнейшего совершенствования этого биосенсора. Однако благодаря большому сроку службы сенсоров (до четырех недель) и исключительно низкой стоимости листья и их фрагменты как биокатализаторы вполне могли бы конкурировать с иммобилизованными ферментами и клетками.

 Митохондриальные биосенсоры

Наряду с цельными фрагментами  тканей млекопитающих в биосенсорах можно эффективно использовать фракции тканевых клеток, иммобилизуя именно те субклеточные компоненты, которые обладают наибольшей биокаталитической активностью. Такой подход может быть весьма плодотворным, если необходимо увеличить количество иммобилизованного фермента или улучшить избирательность сенсора, устраняя мешающие ферменты, которые содержатся в других частях клетки. Показано, что некоторые субклеточные фракции можно использовать как аналитические реагенты. Так. для определения тироксина можно использовать микросомы печени крысы [34]. Первой удачной попыткой создания биосенсора на основе субклеточной фракции был биосенсор для определения глутамина [8]. В этом сенсоре митохондриальную фракцию клеток кортекса почки свиньи иммобилизовали на газоаммиачном датчике. Митохондрии содержат два изофермента глутаминазы [15], активность которых и используют в глутаминовом биосенсоре.

Митохондриальную фракцию клеток почки свиньи выделяют по стандартной методике, включающей дифференциальное центрифугирование [26]. Полученную митохондриальную фракцию иммобилизуют с помощью обычной диацетилцеллюлозной диализной мембраны. Собранные биосенсоры помещают в буферный раствор (0,120 М хлорида калия, 0,02 М Трис-хлорида, 0,04 М Трис-фосфата, 0,005 М сукцината, 1 мкг/1,5 мл ротенона, 0,02% азида натрия) с рН 8,5. Сенсоры хранят и используют при комнатной температуре.

Аналитические характеристики митохондриального электрода сравнимы с характеристиками тканевых и бактериальных электродов и намного превосходят полученные в системе с выделенным ферментом (табл.3.2). Селективность митохондриального глутаминового биосенсора оказалась очень высокой [8].

Успех в создании митохондриального биосенсора показывает, что субклеточные материалы могут служить эффективными биокатализаторами. Хотя это и не относится к рассмотренному глутаминовому биосенсору, субклеточные фракции можно использовать для улучшения чувствительности и избирательности биосенсора в тех случаях, когда цельные фрагменты тканей не обладают необходимыми свойствами.

 Амперометрические биосенсоры

Амперометрическое детектирование находит  широкое применение при анализе  биологических сред. В оптимальных  условиях метод позволяет определять концентрации до 10~8-10~9 М, при этом величина сигнала варьируется в пределах трех-четырех порядков. В связи  с биосенсорами имеет смысл рассмотреть основные особенности амперометрии и их влияние на сигнал детектора.

Наложение разности потенциалов между  электродом сравнения и индикаторным электродом приводит к росту тока, который в свою очередь зависит  от концентрации анализируемых электроактивных частиц в растворе. Измеряемый ток может быть непосредственно связан со скоростью электрохимической реакции, протекающей на индикаторном электроде. Важно, однако, найти и научиться контролировать условия, от которых зависит, какая стадия лимитирует скорость всего электрохимического процесса. Скорость гетерогенного переноса электрона (/ст), протекающего непосредственно на электроде, можно контролировать, изменяя приложенный потенциал в соответствии с уравнением Бутлера - Фольмера [10]. Таким образом, во многих системах можно выбрать такое значение потенциала, чтобы ток не лимитировался гетерогенным переносом электрона, даже если этот процесс необратим. При выполнении этого условия скорость определяющей стадией может быть диффузия (массопере-нос), адсорбция или химические реакции. Суммарный ток сенсора описывается следующим выражением:

В него входят два диффузионных члена  iid и /ed, которые определяются скоростями внутренней и внешней диффузии соответственно. Последний связан с диффузией в объеме раствора вплоть до электрода или границы раздела мембрана/раствор. Внутренняя диффузия включает движение соответствующих частиц в мембране или реакционном слое. Суммарный ток определяется также переносом заряда или адсорбцией реагирующих частиц на мембране или поверхности электрода (; '2d). Перемещение частиц определяемого вещества из раствора к сенсору может сочетаться с химической реакцией, протекающей с конечной скоростью (7к). Следует, однако, подчеркнуть, что члены уравнения (11.1) не являются совершенно независимыми друг от друга.

Многие биосенсоры работают при постоянном потенциале, что существенно упрощает приборное оформление. Однако при этом всегда наблюдается фоновый ток, величина которого может быть значимой при низких концентрациях определяемого вещества. Коррекция фонового тока и градуировка биосенсоров in vivo-две серьезные проблемы, которые требуют надежного решения. Колебания этих параметров могут быть обусловлены "отравлением" электрода компонентами среды. Ухудшается также чувствительность и время отклика биосенсора. Если флуктуации базовой линии обусловлены колебаниями концентраций эндогенных электроактивных мешающих частиц, то можно использовать двухэлектродную (дифференциальную) систему. Этот подход использовали при конструировании глюкозного датчика, где один электрод покрыт мембраной на основе глюкозооксидазы, а другой-мембраной, не содержащей фермента. Предполагается, что электроактивные примеси одинаковым образом диффундируют через обе мембраны [60]. В случаях, когда электрод загрязняется примесями из матрицы или продуктом электрохимической реакции, его подвергают многоимпульсной ступенчатой обработке при разных потенциалах [45, 52]. Этот способ позволяет одновременно провести как обработку электрода (в том числе удаление накопившихся на его поверхности пленок), так и установку базовой линии в области потенциалов, в которой отсутствует электролиз. Применяют также различные виды импульсной полярографии, вольтамперометрию (циклическую или с линейной разверткой потенциала). Последняя особенно полезна в двух случаях, описываемых ниже. Многие нейроактивные вещества окисляются при очень близких значениях потенциалов, и поэтому их трудно различить. Полная циклическая вольтамперограмма отражает различие в химических свойствах продуктов электролиза. Она может служить, с одной стороны, для качественного анализа, как "отпечаток пальца" исследуемой системы [56], а с другой-для количественного описания протекающих в ней электрохимических процессов. Недавно было показано [61], что представляющие интерес для биологии органические молекулы могут концентрироваться на обработанной поверхности электрода. При линейной развертке потенциала осадок определяемого вещества удаляется с поверхности, давая четко выраженный пик.

Амперометрия является перспективным направлением развития биосенсоров для применения как in vivo, так и in vitro. Широкий динамический диапазон концентраций (104-105) позволяет более широко применять ее на практике, чем потенциометрическое детектирование. Проблема заключается лишь в эффективном сопряжении специфических биохимических реакций с процессами, обуславливающими отклик электрода. Такие сенсоры могут функционировать в исключительно неоднородной среде и (в случае имплантируемых сенсоров) при температуре 37 °С.

Возможное использование  биосенсоров, применение биосенсоров  в клинической медицине

Биосенсор in vivo можно определить как небольшой датчик зондового типа, который вводится либо прикрепляется к телу для непрерывного определения (без добавления реагентов) концентрации веществ, представляющих интерес для выявления патологии или терапии.

В литературе многие сенсоры описывают  как потенциально имплантируемые, однако, хотя они нередко представляют собой  значительные научные достижения, их авторы уделяют мало внимания клиническому подтверждению возможности непрерывного мониторинга концентрации того или  иного вещества. Любой in vivo биосенсор (до тех пор, пока они не станут в целом безвредны) представляет риск для пациента или добровольца. Поэтому, выбирая вещество для непрерывного мониторинга, важно установить критерии отбора. По нашему мнению, прежде всего это должно быть вещество, концентрация которого меняется так быстро (как, например, в случае глюкозы в крови или артериального давления кислорода, />аО2), что обычный анализ in vitro не позволяет адекватно следить за ходом этого изменения метода в минуту. Во-вторых, изменения концентрации должны иметь физиологическое или клиническое значение. Общая цель развития in vivo биосенсоров в медицине заключается в том, чтобы улучшить контроль состояния пациентов, и, если исходить из приведенных выше соображений, в настоящее время основными компонентами, для которых имеет смысл непрерывный мониторинг, являются содержащиеся в крови газы, рН, глюкоза и калий.

В будущем, возможно, будут разработаны  системы с замкнутым контуром, в которых с помощью биосенсоров будут непрерывно контролироваться уровни содержания различных лекарственных веществ в крови, а скорости их поступления из подающего насоса будут регулироваться с помощью обратной связи, что позволит поддерживать их концентрации в узком терапевтическом диапазоне. Значительный интерес представляют и незамкнутые системы для контролируемого введения нескольких лекарственных препаратов [38, 45].

В определенных обстоятельствах имплантируемые биосенсоры могут быть также полезны для периодического аналитического контроля. Теоретически миниатюрные сенсоры должны обеспечивать: доступ в строго ограниченные области в организме; возможность проведения измерений в малых объемах физиологических жидкостей (например, интерстициальной жидкости) без их расходования или удаления; быстрое получение результатов. Можно предположить, что эти достоинства сенсоров можно было бы успешно использовать, например, в ходе хирургической операции, для обнаружения определенных веществ непосредственно в ткани или в сосуде с отсасываемой из нее кровью. Это позволило бы локализовать опухоль, гарантировать правильность удаления и даже установить ее биохимическую природу.

Газы крови

У здорового человека парциальные  давления кислорода и диоксида углерода в артериальной крови поддерживаются в строго контролируемых пределах (p. dO2 = = 12,6-13,3 кПа; />аСО2 = 4,5-6,1 кПа). Однако при различных нарушениях и болезненных состояниях, прежде всего воздействующих на сердечно-сосудистую и дыхательную систему или регуляцию метаболизма (см. ниже), измерения раО2 и РаСО7, если не принять соответствующих мер по их корректированию, могут приводить к серьезным, а иногда и фатальным клиническим последствиям.

Нарушения, сопровождаемые отклонениями от нормы газового состава крови:

Дыхательная недостаточность у  детей

Дыхательная недостаточность у  взрослых

Хроническая закупорка легких

Сердечная недостаточность

Врожденные пороки сердца

Операции на сердце

Имеется три категории пациентов, для которых целесообразно ввести непрерывный мониторинг газового состава  крови: недоношенные новорожденные, пациенты с острой сердечно-сосудистой или дыхательной недостаточностью (особенно требующие искусственной вентиляции легких) и, наконец, пациенты, подвергающиеся операции на открытом сердце.

Мониторинг калия

Калий имеет первостепенное физиологическое  и патологическое значение. Это основной катион, присутствующий внутри клеток. Он играет важную роль в поддержании  мембранного потенциала электрически возбудимых клеток, например клеток сердечной  мышцы или нервных тканей. В  норме концентрация К+ в плазме поддерживается в узком диапазоне (3,8-5,5 ммоль/л), но этот тонкий баланс может нарушаться при многих заболеваниях, в том числе болезнях почек, надпочечников и желудочно-кишечного тракта, сахарном диабете, а также лекарственной терапии (например, при использовании диуретиков). Изменение содержания К+ может существенно влиять на сердечный ритм: гиперкалиемия (наиболее серьезное нарушение, связанное с калием) вызывает брадикардию, фибрилляцию желудочков и, в тяжелых случаях, остановку сердца. Действительно, непрерывный мониторинг К +, очевидно, имеет наибольшую ценность для пациентов, страдающих сердечными заболеваниями (по-видимому, изменения концентрации К+ из-за болезни почек или диабета происходят не так быстро, чтобы обычного анализа in vitro было недостаточно).

Рядом исследователей разработаны  катетерные калийселективные сенсоры либо на основе обычного потенциометрического ионоселективного электрода с использованием валиномицина в качестве ионофора [55, 58], либо твердотельных приборов типа ионоселективных полевых транзисторов (ИСПТ), покрытых ионоселективной мембраной [34].

Одно из наиболее интересных и полезных приложений К+-сенсоров описано в работе [58]. Два пациента подвергались чрескожной пластической операции транспазушных сосудов сердца с использованием катетерного баллона Грюнзига для расширения коронарной артерии (эта новая методика была разработана, чтобы избежать серьезного хирургического вмешательства при необходимости расширить суженные кровеносные сосуды). Калиевый электрод вводили этим пациентам в коронарный синус (в который поступает кровь, циркулирующая через сердечную мышцу). Было проведено три последовательных раздувания баллонного катетера в течение 20 с с интервалами в 80 с. В ходе ангиопластической окклюзии пациенты не испытывали боли в груди; на электрокардиограммах, регистрируемых на поверхности тела, заметных изменений также не было. При раздувании баллона не наблюдалось изменений концентрации К+ в коронарном синусе, но через 4,5 с после спускания баллона уровень К+ временно повышался на 0,3 ммоль/л выше базовой линии (4,0 ммоль/л). Этот эффект интерпретировали как отмывку от К+ из миокардиальных клеток, происходящую через несколько секунд после ишемии. Если уровень содержания К+ в коронарном синусе действительно может служить для раннего выявления миокардиальной ишемии, то постоянно находящиеся в синусе К+-электроды могут быть полезны при лечении пациентов после острого инфаркта миокарда или хирургической операции на коронарной артерии.