Биотехнология

В 1980 г. в пронуклеус зиготы мыши была инъецирована плазмида pBR322, содержащая вставку генов вирусов SK40 и HSV. У трех мышей (3,8%) из 78 найдена ДНК, что подтвердило хромосомную интеграцию, однако ДНК подверглась реорганизации.

При инъецировании  гена   -глобина человека в комплексе  с геном ТК HSV в пронуклеусы зигот мыши установлена интеграция у пяти из 33 плодов (15,1%), извлеченных на 16—17-йдень.

Проведена микроинъекция в пронуклеус зиготы гена   -глобина кролика, экспрессия наблюдалась у пяти мышей.

Бринстер  и др. инъецировали в пронуклеусы  зигот мышей комплекс, включающий металлотионеин мыши с геном тими-динкиназы с промотором, интеграция была отмечена у семи из 41 мыши (17%), экспрессия наблюдалась у четырех особей. Наиболее активная экспрессия отмечена в печени и почках.

Революционные достижения в биологии, особенно в генетике, позволили создать принципиально новые биотехнологии, генетическая инженерия стала признанной, перспективной технологией.

В середине 70-х годов были открыты микробные  ферменты, позволяющие разрезать  молекулы ДНК в совершенно определенном месте, то есть выделять нужные ее участки, что позволило искусственно сливать гены или создавать рекомбинантную ДНК.

Стало возможным идентифицировать и клонировать  определенные гены. Выбранный ген должен иметь какую-либо биологическую функцию, которая может быть детектирована. Выделенный ген должен быть введен в ДНК-молекулу переносчика или вектора — посредника при переносе гена. Таким образом, ген может быть перенесен из организма донора в организм реципиента, который впоследствии будет в состоянии реплицировать чужеродный ген. Следовательно, чужеродный ген в организме реципиента будет не только действовать, но и реплици-роваться.

Генная  инженерия в основном состоит  из выделения из одного организма гена (ДНК), определяющего желательный признак, и переноса его в другой организм, который получает новый генетически наследуемый признак.

Современная биотехнология создает возможность  передачи отдельного гена или блока  генов, контролирующих определенный признак. Такой ген может быть перенесен из любого организма в любой другой организм. При этом в новом организме он будет, вероятно, способен проявлять свойственную ему экспрессию, то есть проявляться в фенотипе. При этом организмом-реципиентом может быть как растительная, так и животная форма.

Использование биотехнологии в  селекции животных

Параллельно с генной инженерией разработан ряд  других направлений биотехнологий. Одно из них — трансплантация оплодотворенных  яйцеклеток и ранних эмбрионов. Этот метод успешно применяется в  работе с крупным рогатым скотом начиная с 1951 г. Его используют для получения потомства от наиболее ценных животных.

Метод трансплантации эмбрионов стал одной  из технологий генетической инженерии  в работе с животными. Первым шагом  в этом плане стала успешная трансплантация оплодотворенных яйцеклеток, в ядро которых был введен чужеродный ген путем микроинъекции.

Опыты на лабораторных животных быстро переросли  в технологии, практически применяемые уже на практике. Для получения рекомбинантных продуктов используют бактерии, грибы и все чаще клетки животных. Это позволяет получать искусственным путем белки, которые в норме продуцируются только животными. Нужные гены были перенесены в соответствующие организмы, в которых и проявляли экспрессию .

Этот  метод широко используется в медицине и ветеринарии. В качестве примера можно привести ренин, используемый в сыроварении. Широки возможности получения таким путем и ферментов, используемых для изготовления моющих средств и в приготовлении пищи.

В настоящее  время исследования направлены на создание системы ферментов для получения глюкозы из целлюлозы. Гены, контролирующие выделение ферментов, которые обнаружены у медленнорастущих грибов, были клонированы и перенесены в быстрорастущие бактерии и дрожжи. Это позволило создать эффективную технологию получения из целлюлозы древесины легкопереваримых углеводов. Проводятся работы по получению ферментов, участвующих в гидролизе лигнина, что позволяет создать технологию его расщепления на более простые молекулы, а это в дальнейшем даст возможность получать биогаз или одноклеточный протеин. Это может стать основой технологии обработки грубых, целлюлозсодержащих кормов (биомасса и т. д.).

Развернуты  работы по получению трансгенных  животных. Установлено, что мышь из трансплантированной яйцеклетки может иметь одну копию гена гормона роста или несколько таких копий в своих хромосомах. Гормон роста программируется геном, стимулирует рост организма и определяет конечный его размер.

Гены, контролирующие образование гормона роста (как крысы, так и человека), уже изучены при введении в организм мыши. Все это указывает на реальную возможность использования методов генной инженерии при работе с высшими животными. Такая технология разрабатывается. При этом в первую очередь следует использовать гены, контролирующие интенсивный рост животных и эффективную их продуктивность. Исследователи этой проблемы нередко сталкиваются и с нежелательными последствиями введения чужеродного гена, в частности с потерей фертинга.

Генная  и клеточная инженерия широко используются в ветеринарии. Большие потери при воспроизводстве скота и птицы вызываются различными заболеваниями. Особенно большой ущерб наносят инфекционные заболевания. Для борьбы с рядом болезней успешно применяют различные вакцины. Методами генной инженерии можно получить такие вакцины, которые невозможно получить традиционными методами. Эти вакцины могут быть более безопасными, дешевыми и стабильными по сравнению с существующими.

Иммунная  реакция — мощный защитный механизм у животных. При попадании в организм чужеродного белка определенные клетки продуцируют антитела, призванные нейтрализовать его. Установлено, что определенная часть молекулы протеина является антигенной детерминантой. При помощи рентгенографии и кристаллографии можно не только увидеть структуру белка, но и установить локализацию антигенной детерминанты.

Возможность наблюдать трехмерную структуру  антигенного сайта уже позволяет  синтезировать полипептидную структуру, которая может служить в качестве синтетических антигенов для использования в вакцинации.

Гены, контролирующие образование таких полипептидных  антигенов, могут быть синтезированы  и введены в клетки, которые будут в массе продуцировать антигены.

Важнейшая биотехнология для ветеринарии  — гибридомная. Путем инъекции антиген вводят мыши. Клетки костного мозга мыши, продуцирующие антитела, сливаются (смешиваются) с клетками, способными расти в культуре (миеломные клетки). В результате гибридные клетки продуцируют антитела. Эти клетки можно клонировать. Клеточную линию, продуцирующую желательные антитела, отбирают, и в постоянной культуре она становится источником антител. Этот метод используют для идентификации антигенных белков, а также специфических антигенных сайтов, определяющих образование антител.

В настоящее время эти технологии получают все большее развитие.

Развитие  методов биотехнологии  животных

В отношении  сложнообусловленных полигенных количественных признаков, к которым относятся большинство хозяйственно ценных показателей сельскохозяйственных животных,, в селекции применяются методы популяционной генетики.

Методы  определения изменчивости, повторяемости, наследуемости количественных признаков, генетических корреляций между ними положены в основу современной крупномасштабной селекции.

Все это  дает возможность точно планировать селекционно-племенную работу по улучшению количественных признаков.

Широкое использование информатики и  ЭВМ позволяет создать базу для  оперативного анализа генетической информации в огромных по численности популяциях сельскохозяйственных животных. Все это значительно ускоряет темпы генетического улучшения разводимых в стране пород, активизирует процессы выведения новых линий, типов и пород животных.

Генная  инженерия представляет собой логическое продолжение развития и применения новейших генетических методов в селекции животных. Возможности генной инженерии увеличились в связи с открытиями в области регулирования действия генов. Инъекция клонированного гена ростового гормона человека свиньям и овцам стала возможной в результате двух новых методов биотехнологии — микрохирургии на эмбрионах и рекомбинации ДНК. Микрохирургия на яйцеклетках и эмбрионах и рекомбинация ДНК в принципе открывают возможность более интенсивной селекции животных. Сочетание генетического манипулирования с уже широко распространенными методами / длительного хранения спермы и эмбрионов дает селекционеру/ невиданные возможности более эффективной селекции.

Основные  методы генной инженерии  животных

Успех генной инженерии на животных зависит  от возможности вставок генов  (представляющих интерес)  в геном. Два метода  открывают  большие  возможности  для   вставки   клонированных генов в ядро клетки: перенос генов в пронуклеус и вирусная трансфекция.

Перенос генов с ДНК- Установлено, что  инфекционность ДНК аденовируса 5 в однослойной культуре клеток KB человека может быть значительно повышена путем преципитации вирусной ДНК с помощью фосфата кальция.

Метод оказался эффективным и для других ДНК. Используя перенос генов с помощью ДНК, Виглер и другие смогли перенести ДНК, включающую ген тимидинкиназы (ТК), выделенный из вируса герпеса (HSV-1) в культивированные клетки мыши, в которых тимидинкиназа отсутствует. Полученные в результате этого клоны, содержащие вирусную тимидинкиназу, стабильно поддерживались в течение ряда поколений. Поскольку эффективность трансфекции ДНК с фосфатом кальция невелика, то для отбора клонов клеток, трансформированных по тимидинкиназе, была использована среда HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, не прошедшие трансформацию, не имели ТК, поэтому после трансформации их можно было элиминировать (отбросить) и культивировать в среде, содержащей HAT. Выжили только клоны с функциональной ти-мидинкиназой. Для селекции можно использовать свойство устойчивости к определенным веществам, например неомицину.

Вирусная  инфекция. Вирусная инфекция — естественный путь введения генетической информации в клетки (животных). Кроме того, вирусы используются для трансформации клеток с ценными генами. Проведена работа по инъекции ДНК вируса 5V40 в бластоцель мышиных эмбрионов и пересадке трансформированных эмбрионов в матку псевдобеременных мышей. Эта ДНК обнаружена у 25 из 29 мышей, полученных из 80 инъецированных эмбрионов. Анализ на гибридную ДНК показал, что 10 мышей были носителями ДНК вируса SVO. Вирусная ДНК была неравномерно распределена по тканям, вероятно, в связи с неодинаковым уровнем инфицирования клеток внутренней клеточной массы или в результате гибели некоторых линий эмбриональных клеток, несущих вирус, в процессе развития.

Показано, что мыши, зараженные вирусом лейкемии Молони на стадии 4—8 клеток, стабильно  содержали одну копию вируса в  своем геноме. Вирус передавался  потомству как менделевский доминантный  признак. Мыши II поколения были заражены и поражались лейкемией. Проявление вируса у взрослых животных варьировало: у некоторых линий мышей развивалась ранняя лейкемия, а у других заболевание развивалось в более позднем возрасте.

Одно  из возможных последствий внедрения  гена с применением любых способов — образование вставочных мутаций, то есть изменений в функции собственного гена в результате вставок чужого гена в него или около него. Одна линия мышей, трансформированных вирусом лейкемии Молони, не могла быть доведена до гомозиготности. В результате ранней эмбриональной смертности гомозиготных эмбрионов продукт полного доминирования гена в процессе развития отсутствовал.

Получение мутантов путем вставок открывает  огромные возможности для генетических исследований.

Данные  об использовании ретровируса для  трансформации клеточных линий млекопитающих по функционально неселектируемому гену в литературе не встречаются. Однако Миллер и другие описали синтез поддающегося селекции ретровируса, содержащего миниген, контролирующий ростовой гормон крысы, который может инфицировать культивируемые клетки и обусловливать выработку большого количества ростового гормона. Вставка вирусов в клеточный геном происходит в одном месте без перестройки. Было установлено, что изменение характера проявления действия гена обусловлено первоначальным местом его встройки, а не последующей модификацией.

В настоящее  время разработаны системы различных  ретро-вирусных векторов, обеспечивающие надежные трансфекции чужеродных генов  в организм птиц и млекопитающих.