Генная инженерия

      Казалось бы, что на рубеже 70-х  годов молекулярная биология  достигла определённой степени  завершенности: были установлены  структура и механизм репликации  ДНК, провозглашена «центральная  догма» экспрессии гена (транскрипция  и трансляция), выявлены основные  аспекты регуляции активности  гена. В этот период главным  объектом молекулярно-генетических  исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам (включая человека) встретился с дополнительными проблемами и трудностями, и кроме того, существовавшие в то время методы не позволяли рассчитывать на получение принципиально новых результатов. Стремительный порыв в развитии молекулярной генетики в начале 70-х годов стал благодаря появлению нового экспериментального инструмента – рестриктационных эндонуклеаз. Был открыт путь для широкомасштабного получения генных продуктов (физически значимых белков) и для генетического манипулирования с различными организмами. Наши знания о структуре генетического материала и эукариот, в разных областях таких как: действие гена, популяционная генетика, эволюция и генетическая консультация, включая пренатальную диагностику. Достигнутые успехи заставили ученых задуматься об этической стороне манипулирования с человеческим зародышем, об возникновения возбудителей различных болезней в процессе генно-инженерных исследований. Многие из этих вопросов были подняты самими учеными активно работающих в данной области. В настоящее время большинство исследователей считали, что опасения касающиеся, генной инженерии, не имеют достаточно оснований, но многие этические проблемы остаются нерешенными и продолжают возникать    новые [1].

    В прошлом генетика и медицинская  генетика развивалась как относительно независимые отрасли науки, теперь многие из их разделов оказались вовлечённые  в общее русло молекулярно-генетических исследований, и провести между ними грань трудно [8].

    На  данный момент множество ученых заняты различными работами связанные с проблемами генной инженерии – это и методы, основанные на использовании рестриктационных ферментов, анализ гена человека, методы гибридизации нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК, сортировки хромосом при помощи цитофиурометрииии и многое, многое другое.

    Условия, которым должен соответствовать ген человека, что бы получить полную характеристику его структуры:

    - соответствующие фрагменты ДНК должны быть идентифицированы однозначно;

    - они должны быть выделены и накоплены в количестве, должностном для биохимического анализа;

    - должна быть определена вся нуклеотидная последовательность [3].

    Принципы, на которых основаны эти три метода, кратко описаны ниже.

    1.2.2 Рестриктационные эндонуклеазы             

    Рестриктация чужеродной ДНК осуществляется ферментами, называемыми рестриктационными эндонуклеазами (рестриктазами). Эти ферменты вступают в реакцию с определенными участками в ДНК, так называемыми сайтами узнавания, которые в клетке защищены метильными группами (метилированы). Правда, первые из открытых эндонуклеаз не были специфическими, а действовали случайным образом. Первой рестриктазой, которая расщепляла ДНК, в строго определенном месте, была Hind, открытая Смитом в конце 60-х годов. Этот фермент впервые использован Натсоном и соавторами для создания рестриктационнй карты генома вируса  SO₄₀. Берг уловил особое свойство двухцепочной ДНК формировать при обработке рестриктазами так называемые «липкие концы». После разрезания одна из цепей оказывается длиннее, чем другая, на несколько нуклеотидов. Эти нуклеотиды могут свободно спариваться с другими, например с комплиментарными нуклеотидами другого фрагмента ДНК с «липкими концами». Благодаря этому, ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы [1].

 

    1.2.3 Принципы технологий рекомбинантных ДНК 

    Было  выделено много рестриктаз (более 150), расщепляющих ДНК в специфических сайтах. Например: эндонуклеаза  R1 регистрирует двухцепочную ДНК по двум сайтам таким образом, что образуются два липких конца:

                                                                    ¯

    G-A-A-T-T-C

    |||  ||  ||  ||  ||   |||

    C-T-T-A-A-G

                    ­

    Липкие  концы различных молекул ДНК, расщеплённых этим ферментом, могут  вступать по четырём –A-T-парам. Рестриктационные эндонуклеазы различаются по тем сайтам   ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их применение для амплификации специфической определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, необходимо для ДНК или для изучения механизмов экспрессии генов. Последняя проблема наиболее важна в практическом аспекте: гены контролирующие образование функционально активных белков, теперь можно вводить в бактерии и размножать (амплифицировать). Эта процедура называется клонированием генов. Благодаря ей появилась возможность вырабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить ничтожно мало. Эта технология основана на следующем принципе: помимо своей собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК, называемые плазмидами [4].

    Плазмиды  реплицируются автономно и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ, например: колицинов, убивающих другие бактерии (рисунок 1).

    Плазмидную  ДНК можно выделить и расщепить подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами. Фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же липкими концами (полученными после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидой ДНК с помощью лигазы [3].

 

    Рисунок 1 - Клетка E-coli с хромосомой и плазмидой 

    Рекомбинантную  конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется (рисунок 2). 

    

    Рисунок 2 - Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием эндонуклеазы  

    Источник  экзогенной ДНК не имеет значения. ДНК может быть получена, например, из клеток человека, но можно сшивать  и искуственно синтизированные  гены. Кроме бактериальных плазмид  в качестве векторов (носителей) ДНК  используют фаги λ (объект исследования Альберта). Часть генома этого фага не обязательна для его размножения в бактерии. Вместо него можно ввести чужеродную ДНК, которая будет размножаться вместе с фаговой, после инфицирования    бактерий [4]. 

    Для генной инженерии белков недостаточно отобрать и размножить определённые фрагменты ДНК, необходимо ещё индуцировать их экспрессию в клетке. Для этого  необходимо «подключить» рекомбинантную молекулу ДНК, последующую трансляцию матричной РНК и процессинг как на транскрипционном, так и на трансляционных уровнях [1].    

    1.2.4 Идентификация анализов гена  

    Ещё одна область применения рестриктаз – идентификация и определение  числа генов. Эти задачи решаются с помощью метода разработанного Саузерном.

    Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют  эндонуклеазой примерно на 500000 фрагментов длиной от 10² до 10⁵ нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель- электрофореза в ага розе, после чего ДНК денатурирует с щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 80⁰С. В результате получается отпечаток (реплика) картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определённых генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде тёмной полосы.

    Главное условие такого анализа - наличие  подходящего геноспецифического радиоактивного ДНК-зонда, который можно использовать для гибридизации [8]. 

    1.2.5 Гибридизация нуклеиновых кислот 

    Способность к гибридизации цепей ДНК лежит  в основе многих методических приёмов  молекулярной биологии. Большинство  природных ДНК встречается в  виде двухцепочных молекул. Их устойчивость поддерживается благодаря тому, что  пиримидиновое основание цитозин (C) спаривается с пуриновым основанием гуанином (G), в то время как пиримидиновое основание тимин (T) спаривается с пуриновым основанием аденином (A). Эти комплиментарные пары оснований удерживаются водородными связями (тремя в паре G-C и двумя в паре A-T), которые относительно легко разрываются, при этом одноцепочные фрагменты ДНК, присутствующие в растворе, снова формируют двойную спираль. Для реассоциации не имеет значения происхождения одноцепочной ДНК, не требуется даже полной комплиментарности отдельных цепей. Реассоциация происходит даже тогда, когда какая-то часть оснований в каждой цепи не комплиментарна. Одноцепочная ДНК может спариваться, то есть гибридизироваться даже с РНК, если у них есть комплиментарные основания [4].

    Метод гибридизации полезно использовать, например, для анализа очень протяженного гена. При этом с помощью подходящего зонда из геномной библиотеки ДНК первоначально извлекается какая-то часть такого гена. Нуклеотидная последовательность этой части гена будет, как правило, длиннее зонда, и её концы будут перекрываться с другими фрагментами данного гена в этой библиотеке, то есть будут, по крайней мере, частично гибридизироваться с ними. Свободные концы этих фрагментов будут гибридизироваться со следующими и так далее, пока весь структурный ген не будет полностью идентифицирован серией перекрывающихся фрагментов. Именно таким образом был реконструирован структурный ген фактора свертывания крови VII человека, необычно длинный, состоящий из 180000 пар нуклеотидов [3].

    Существующий  метод гибридизации in situ, этот метод уже усовершенствован на столько, что с его помощью можно локализовать в хромосомах даже уникальные гены, такие как ген инсулина. Вот пример некоторых генов человека, идентифицированных с помощью гибридизации (таблица 1) [2]. 

    Таблица 1 - Некоторые гены человека, идентифицированные с помощью гибридизации. 

 
 

    1.2.6 Сортировка хромосом 

    Этот  метод может быть использован  в двух разных целях:

    - для идентификации и количественного анализа большого числа хромосом в течение очень короткого времени;

    - для препаративного разделения хромосом, который имеет два преимущества перед стандартными методами анализа хромосом: полностью автоматический, благодаря чему исключается элемент субъективности и намного быстрее (рисунок 3).

    Однако  важнее, что этот метод позволяет  препаративно разделять хромосомы, и при наличии специфических зондов исследовать структуру и функцию отдельных генов становится относительно просто. В этом случае ген можно локализовать в хромосоме с помощью гибридизации in situ, размножить его ДНК путём клонирования и секвенирования. 
 

    Рисунок 3 - Принцип сортировки хромосом с помощью лазера 

    Хромосомы окрашены флуоресцирующим красителем. Флуоресценция возбуждается лазерным лучом и измеряется для каждой хромосомы отдельно. Данные измерений  используют для сортировки хромосом [4].  

    1.2.7 Секвенирование ДНК 

    Методы  определённой последовательности аминокислот  в полипептидной цепи были известны ещё в 50-х годах. Теоретически это  относительно лёгкая проблема, поскольку  все 20 аминокислот, встречающихся в  природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу  однородных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований  – гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда в 60-е годы был расшифрован  генетический код, появилась возможность  восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько нуклеотидных триплетов. Следовательно, сведения о нуклеотидной последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодирующих участков ДНК. Принцип состоит в следующем: длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющихся в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очерёдность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающие концы: идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности, перекрывающихся образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно осуществляется очень легко и быстро. Для этого необходимо длинную молекулу ДНК с помощью рестриктазы разделить на фрагменты удобного размера, а затем, если нужно, мощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно осуществляется очень легко и быстро. Для этого необходимо длинную молекулу ДНК с помощью рестриктазы разделить на фрагменты удобного размера, а затем, если нужно, сведения и о нетранскрибирусных участках ДНК, важных для контроля транскрипции (так называемые операторы и промоторы) [1].