Энтомопатогенные препараты на основе бактерий

Энтомопатогенные  препараты на основе бактерий

Препараты, производимые для сельского хозяйства, делятся  на 3 группы:

- энтомопатогенные препараты;

- бактериальные удобрения;

- антибиотики 

Энтомопатогенные  препараты 

Отечественное биотехнологическое производство выпускает 3 группы энтомопатогенных препаратов:

1. Бактериальные  препараты на основе Bacillus thuringiensis - энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин. 

2. Грибной препарат  боверин на основе гриба Beauveria bassiana.

3. Препараты  на основе вирусов ядерного полиэдра (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и др.). 

Все микробные  патогены выпускаются в виде смачивающих  порошков, паст, реже - гранул, эмульсии спор и кристаллов. При непосредственном применении предполагается использование  различных добавок в виде растворителей, прилипателей, способствующих повышению их эффективности. Технология получения бактериальных энтомопатогенных препаратов Наибольшее распространение среди промышленно выпускаемых микробных патогенов получили бактериальные препараты. Их отличительными особенностями являются высокая вирулентность по отношению к насекомым-вредителям, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно высокая скорость воздействия на вредителей и др. В настоящее время производятся препараты против более 160 видов насекомых.  

Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее исследованы грамположительные  бактерии Bac.thuringiensis. Она не только разрушает  насекомое, попадая внутрь, но и продуцирует  ряд токсичных продуктов. Среди  этих токсичных продуктов выделяют 4 компонента:  

- α-экзотоксин, или фосфолипаза С, - продукт растущих  клеток бактерий. Токсическое действие  фермента связывают с индуцируемым  им распадом незаменимых фосфолипидов  в ткани насекомого, что приводит  к гибели последнего.  

- β-экзотоксин - накапливается в культуральной жидкости при росте клеток. Считают, что молекула β-токсина состоит из нуклеотида, связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой. Его действие, видимо, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, что приводит к прекращению синтеза РНК. По сравнению с другими токсинами действует медленнее, в основном при переходе от одного цикла развития к другому. По наблюдениям, β-экзотоксин - мутаген, поражающий генетический аппарат особей.  

- γ-экзотоксин - малоизученный компонент, неидентифицированный  фермент (или группа ферментов).  

- δ-эндотоксин - параспоральный кристаллический  эндотоксин. Образуется в процессе  споруляции бактерии в противоположной  от формирующейся споры части  бактерии. На завершающей стадии спорообразования токсин приобретает форму 8-гранного кристалла. Кристаллы состоят из белка, аминокислотный состав которого близок для различных штаммов. Доказано, что кристаллический белок в кишечнике восприимчивых насекомых распадается на молекулы протоксина. Протоксин под действием протеиназ распадается на токсические фрагменты. Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к действию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специальных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристаллов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, отсюда и избирательность действия δ-токсина. Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы перестают питаться. Первичным местом действия δ-токсина является средний отдел кишечника.  

В зависимости  от реакции на кристаллы насекомые  делятся на три группы:

характерен общий  паралич;

паралич среднего отдела кишечника;

реакция на препарат в целом: гибель в результате прорастания  спор и последующего размножения бактерий. 

Бактерии Bac. thuringiensis антагонистичны к 130 видам насекомых. Наибольший эффект достигается при  применении препаратов этой группы против листогрызущих вредителей. Наиболее распространенные препараты на основе различных вариаций Bac. thuringiensis: энтобактерин, инсектин, алестин, экзотоксин, токсобактерин, дендробациллин, битоксибациллин.  

Промышленное  производство энтомопатогенных бактерий заключается в глубоком культивировании. При этом ставится задача получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина. Требования к промышленным штаммам энтомопатогенных бактерий: принадлежность штамма к определенному серотипу, высокая вирулентность и продуктивность на промышленных средах, устойчивость к комплексу фагов и т.д. Технология производства включает все стадии, типичные для любого биотехнологического производства. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной (28-30оС), продолжительность ферментации составляет 35-40 часов. Используют дрожже-полисахаридную среду, содержащую в процентах: кормовые дрожжи - 2-3; кукурузную муку - 1-1.5; кашалотовый жир - 1. Перед началом культивирования рН составляет около 6.3, к концу ферментации - повышается до 8.0 - 8.5, что может привести к разрушению кристаллов на более мелкие фрагменты и затруднить их выделение. Чтобы предотвратить это, культуральную жидкость перед переработкой подкисляют до 6.0 - 6.2. Культивирование заканчивают при степени споруляции 90-95% и титре спор не менее 109 в 1 мл. После сепарации культуральной жидкости получают пасту влажностью 85% с выходом около 100 кг в 1 кубометре культуральной жидкости и титром порядка 20*109 спор в 1 грамме. Фугат можно употребить для приготовления питательной среды, но не более 1-2 раз, так как в культуральной жидкости накапливаются вещества, ингибирующие развитие культуры. Фугат находит свое применение в качестве сырья при производстве кормовых дрожжей, что обеспечивает сокращение промышленных стоков и снижает расход воды. Пасту перемешивают в течение получаса для однородного распределения спор и кристаллов и отбирают пробы на проверку титра, влажности, вирулентности, наличия фага.  

Конечный продукт - смачивающий порошок или стабилизированная  паста. Первый получают путем высушивания  увлажненной пасты на распылительной сушке. Готовый препарат фасуют по 20 кг в четырехслойные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем. Вторую - внесением в пату КМЦ. При смешении молекулы КМЦ сорбируют белковые кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует равномерному распределению активного начала по всему объёму и увеличению срока хранения. Готовый препарат - вязкая жидкость кремового или светло-серого цвета, без запаха, не замерзающую при хранении. Препарат предназначен для борьбы с садово-огородными вредителями, эффективен против 60 видов насекомых. Применяют путем опрыскивания растений водной эмульсией в период активного роста вредителя. Основная масса вредителей погибает в течение 2-10 дней. На 1 га расходуют: для овощных культур 1-3 кг, садовых - 3-5 кг.

Грибные энтомопатогенные препараты 

Энтомопатогенные  препараты на основе микроскопических грибов вызывают у насекомых микозы. Грибы обладают рядом особенностей:

поражение происходит через кутикулу;

 насекомые  поражаются в фазе развития  куколки и имаго;

большая скорость роста и огромная репродуктивная способность, в виде спор могут длительное время находится в природе без снижения энтомопатогенной активности;

высокая специфичность, вирулентность сильно зависит от штамма гриба. 
 

Действие грибного препарата на насекомое начинается с проникновения споры в полость тела через кожные покровы. Попав в тело, спора прорастает в гифу, затем разрастается мицелий, от которого отчленяются конидии. Оказавшись в теле, конидии циркулируют в гемолимфе. Уже на этой стадии возможно поражение насекомого вследствие выделения некоторыми штаммами значительного количества токсинов. В отсутствие токсина мицелий постепенно заполняет все тело насекомого, прежде всего поражается мышечная ткань. Рост гриба продолжается до тех пор, пока все ткани не будут разрушены. Могут образовываться конидиеносцы, прорывающие кутикулу и обволакивающие мертвую личинку.  

В промышленном производстве используются отдельные  штаммы в основном трех родов: Beaveria, Metarrhizium, Entomophtora. В нашей стране освоено  промышленное производство препарата боверина на основе B.bassiana. Готовый препарат - порошок кремового или белого цвета, содержащий в 1 г от 1.5 до 6 млрд. конидиоспор. Препарат безвреден для теплокровных животных и человека, не вызывет ожогов у растений.  

Получать боверин можно используя как поверхностное, так и глубинное культивирование. Первый способ более трудоемок и длителен, поэтому имеет ограниченное значение. Производство конидиоспор при выращивании его в жидкой среде также непростая задача. Основная трудность в том, что при этом способе культивирования гриб размножается вегетативно, образуя гонидии. Гонидии по вирулентности не уступают конидиям, однако неустойчивы к высоким температура на стадии высушивания. При традиционной распылительной сушке погибает 90% гонидиоспор и 20-50% конидиоспор. Проблема решается подбором питательной среды и условий ферментации, обеспечивающих переход 90% выращенных клеток в конидиоспоры.  

Технология получения  боверина методом глубинного культивирования  включает обычные стадии. Питательная среда содержит в процентах: дрожжи кормовые - 2, крахмал - 1, хлорид натрия - 0.2, хлорид марганца - 0.01, хлорид кальция - 0.05. Последний компонент обеспечивает устойчивость конидий к неблагоприятным факторам, поэтому его содержание может сильно варьировать (до 5%). Культивируют при рН 4.5-5.6, температуре 25-28оС 3-4 суток в условиях постоянного перемешивания и аэрации. В среде необходимо также наличие аминного азота, так как его недостаток снижает скорость роста культуры и процент образования конидиоспор, избыток ведет к образованию гонидий. Культуральную жидкость подвергают сепарации и фильтрованию, после чего пасту сушат на распылительной сушке. 

Вирусные  энтомопатогенные препараты

 Из всех  энтомопатогенных препаратов вирусные  обладают наибольшей специфичностью по отношению к насекомому-хозяину. Они поражают не более одного вида. Их ярко выраженная специфичность обуславливает практическую безвредность вирусных препаратов для человека, флоры и фауны.  

Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, они способны сохранять активность в течение 10-15 лет, находясь вне насекомого. Заражение вирусом происходит при питании вредителя. Попавшие в кишечник тельца-включения при щелочных значениях рН разрушаются. Освобожденные вирионы проникают через стенку кишечника в клетки, где в ядрах происходит репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы заражают другие клетки, что в итоге приводит к гибели насекомого. Отличительной особенностью вирусов является то, что они могут размножаться только в живой ткани. Это создает определенные трудности в организации промышленного производства, так как технология размножения вирусов должна быть связана с использованием живых насекомых-хозяев.  

В нашей стране осуществляется выпуск трех вирусных энтомопатогенных препаратов: вирин-ЭКС (против капустной совки), ЭНШ (против непарного шелкопряда) и АББ (против американской белой бабочки).  

Производство  любого из вирусных препаратов начинают с разведения насекомого-хозяина  на искусственных питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития ( обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок. После заражения насекомых выдерживают в строго определенных условиях, обеспечивающих максимальное накопление вируса в тканях. Через 7-9 суток собирают мертвые и отмирающие личинки, подсушивают при температуре 33-35оС, измельчают механическим способом для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь полученных тканей фильтруют.  

При производстве вирин-ЭКС полиэдры осаждают из фильтрата  центрифугированием. Осадок суспендируют в минимальном количестве дистиллированной воды и добавляют простерилизованный глицерин до титра 1 млрд. полиэдров в 1 мл. Готовый препарат разливают во флаконы. При производстве вирин-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотношении 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, осадок подсушивают до полного удаления ацетона. Если препарат планируется выпускать в виде порошка, то сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполнителем (каолином, например) до получения титра полиэдров 1 млрд. полиэдров в 1 грамме.  

Масляную форму  препарата получают путем диспергирования  осадка в стерильном 50% растворе глицерина  до титра 2 млрд. полиэдров в 1 мл, а  затем добавляют равный объем  солярового масла, перемешивают и разливают по флаконам. Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем внесения полиэдров в плотные популяции насекомых-вредителей с целью возникновения в них эпизоотий. Данный способ обработки предполагает внесение небольших количеств препарата. В другом случае опрыскивание или опыление производят на зараженных участках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития.