Клонирование организма

увеличилось,  и  они  развивались  до  более  поздних  стадий  по

сравнению  с  зародышами, полученными  в   результате  первичной  пересадки

 ядер.

Затем  Гёрдон  вместе  с Ласки (1970 г од)  стали культивировать  in

vitro  (вне организма в питательной среде)  клетки  почки, лёгкого и

кожи  взрослых  животных  и  использовать  уже  эти  клетки  в  качестве

доноров  ядер. Примерно  25%  первично  реконструированных  яйцеклеток

развивались  до  стадии  бластулы. При  серийных  пересадках  они

развивались  до  стадии  головастика. Таким  образом,  было  показано, что

клетки  3-х  разных  тканей  взрослого  позвоночного  содержит  ядра,

которые  могут  обеспечить  развитие  по  крайней  может   до  стадии

головастика.

В  свою  очередь  ДиБерардино  и Хофнер  использовали  для трансплантации

 ядра  неделящихся   и  полностью  дифференцированных  клеток  крови –

эритроцитов  лягушки  Rana  Pipiens. После серийной  пересадки таких

ядер  10%  реконструированных  яйцеклеток  достигали  стадии  плавающего

головастика. Однако  даже  с  помощью  многократных  серийных  пересадок

(более  100  клеточных   циклов)  реконструированные  яйцеклетки  дальше

стадии  головастика  не  развивались.

Таким  образом,  во  многих  работах  показано, что  в  случаи  амфибий

донорами  ядер  могут  стать  лишь  зародыши  на  ранних  стадиях

развития.. Некоторые  авторы  называют  подобные  эксперименты

клонированием  амфибий, хотя  правильнее  их  называть  клонированием

эмбрионов  амфибий, так  как  в  этом  случае  размножают  бесполым  путём

не  взрослых  животных, а  их  зародышей.

Дифференцировка  клеток  в  ходе  развития  позвоночных  сопровождается

инактиваций  неработающих  генов, поэтому клетки  теряют  тотипотентность,

дифференцировка  становится  необратимой. В  конце  концов,  у  одних

клеток  происходит  репрессирование  генома, у  других  в  той  или  иной

степени  деградирует  ДНК, а  в  некоторых  случаях  разрушается  даже

ядро. Однако  на  ряду  с дифференцируемыми клетками, культивируемыми in

 vitro  клеточные популяции содержат  малодифференцируемые  стволовые

клетки, которые  и  могут  быть   использованы  как  доноры  ядер  для

клонирования  млекопитающих.

Опыты  с  амфибиями  показали, что  ядра  различных  клеток  одного  и

того  же  организма  генетически  идентичны  и в процессе  дифференцирвки

 постепенно  теряют  способность  обеспечивать  развитие

реконструированных  яйцеклеток, однако  серийные  пересадки ядер  и

культивирование  клеток  in  vitro  в какой-то  степени увеличивают эту

способность.

 

 

         Неудачи  экспериментов  с   мышами.

 

Успешные  опыты  с  амфибиями  заставили  задуматься  учёных  о

клонировании  млекопитающих, в частности мышей.

МакКиннелл  в одной из  своих работах отмечал, что необходимые  для

этого  методы  уже  существуют  и  непонятно  почему  мышь  до  сих  пор

не  клонирована.

Однако  предсказания  МакКиннелла  не  сбылись, хотя  в конце 70-х   гг.

опыты  на  мышах  действительно  начались  и  протекали  весьма

драматично. К  тому  времени  весьма  основательно  были  изучены  биология

 и  генетика  ранних  этапов  развития  млекопитающих   и  в  частности

мыши  как  модельного  объекта.

Работа  методически  оказалась  довольно   трудной, прежде  всего,  потому

что  объём  яйцеклетки  у  млекопитающих  примерно  в  тысячу  раз  меньше,

чем  у  амфибий. Однако  эти  трудности  были  успешно  преодолены.

Экспериментаторы  научились  успешно  микрохирургическим  путём  удалять

пронуклеусы  (одно  из  двух  гаплоидных  ядер  в яйце  млекопитающих, в

период  после  проникновения  сперматозоида, но   до  слияния  женского  и

мужского  пронуклеусов  в ядро  зиготы  в процессе  оплодотворения.

Мужское  ядро  формируется  из  ядерного  материала  сперматозоида, женское

 из  хромосом  яйцеклетки)  из  зигот  мыши  и  пересаживать  в  них

клеточные  ядра  ранних  эмбрионов. Однако  все  полученные  разным

способом  зародыши  мышей  развивались  лишь  до  стадии  бластулы.

В  1977  году  появилось  сенсационное  сообщение  Хоппе  и Илменсе  о

том, что  они  получили  7  взрослых  самок  мышей, пять  из  которых

имели  только  материнский, а  две  отцовский  геном. Это, якобы, зависело

от  того,  какой  пронуклеус  был оставлен  в яйце – женский или

мужской, он  и  определял  особи  по  типу  гиногенеза  или  андрогенеза

(гиногенез – развитие  яйца  без  участия  сперматозоида,  андрогенез –

развитие  яйца, имеющие  только  отцовские  хромосомы  – мужской

партеногенез). Их  успех  был  связан, по  описанию  авторов, с  тем, что,

удаляя  один  пронуклеус, они удваивали число хромосом   другого,

обрабатывая  яйца  специальным  веществом, затем  выращивали  полученные

диплоидные  гомозиготные  зародыши  in  vitro  до  стадии  бластулы  и

пересаживали  в  матку  самки-реципиента  для  дальнейшего  развития.

Казалось, теперь  можно  будет  быстро  получить  млекопитающих  со  100%

гомозиготностью  по  всем  признакам. Это особенно  важно для селекции,

так  как  для  получения  сельскохозяйственных  животных, в  частности

крупного  рогатого  скота  с  закреплёнными  особо  ценными  качествами

обычными  приёмами  требуются  десятки  лет  работы.

Однако  данные  Хоппе  и Илменси  подтвердить не  удалось, хотя  многие

пытались  это  сделать. Оказалось, что  полученные  любым способом

диплоидные  андрогенетические  и  гиногенетические  зародыши  мышей

погибают,  а  тех  же  стадиях, что  и  диплоидные  партеногенетические

(развивающиеся  из  неоплодотворённой  яйцеклетки)    эмбрионы.

Значительно  усовершенствовав  методы  извлечения  ядер  и  введения  их  в

 клетку, МакГрат   и Солтер  провели свою  серию экспериментов и

сообщили, что  высокий  выход  живых  мышей  они  получили, когда  в

качестве  доноров ядер  они использовали  зиготы, но  если  донорами

были  ранние  эмбрионы, то  реконструированные  яйцеклетки, как  и

прежде, развивались  только  до  стадии  бластулы.

Метод  МакГрата - Солтера  стал  широко  использоваться  разными

экспериментаторами. Так  Манн  и  Ловел-Банж  выделяли  пронуклеусы  яиц,

активированных  к  партеногенезу, и  пересаживал  их  в  энуклеированные

зиготы  мышей. В  этих  случаях  эмбрионы  погибали  на  ранних  стадиях.

Если  же, наоборот, пронуклеусы  получали  из  оплодотворённых яиц и

пересаживали  в  партеногенетические  и  лишённые  ядра  яйца, то   такие

зародыши  развивались  нормально  до  рождения.

Сурани  с соавторами  установили, что если  добавить  женские  пронуклеус

  из  зиготы  мыши  к  гаплоидному  набору  хромосом  яйцеклетки, то

нормального  развития  не  происходит, добавление  же  мужского  ядра

приводит  к  нормальному  развитию. С    другой  стороны, рекомбинация

женского  и  мужского  пронуклеусов  из  ранних  оплодотворённых

яйцеклеток  мышей  обеспечивает  нормальное  развитие, а  комбинация  2-х

мужских  или 2-х женских пронуклеусов  останавливает развитие  эмбриона.

Эти  опыты  показали, что  для  нормального  развития  млекопитающих

требуется  два  набора  хромосом – отцовский  и  материнский. Поэтому  ни

у  одного  из  известного  вида  млекопитающих  не  описан  партеногенез.

Поэтому  же  работы  Хоппе  и Илменсе  не  удалось повторить.

Однако  такие  исследование  ещё дважды  будоражили  научное сообщество.

В  1982  году  пересадили  ядра  клеток  партеногенетических  бластул

мышей  в   энуклеированные  зиготы. Некоторые из  этих  реконструированных

 яйцеклеток  нормально   развивались, и  якобы  получены  четыре  взрослых

самки, но  в  свете  вышесказанного  эти  результаты  маловероятны.

Гибель  партеногенетических  (гиногенетических и андрогенетических)

зародышей  у  млекопитающих  связана  с различной активацией  онтогенеза

материнского  и отцовских геномов. Механизм, регулирующий  эти

функциональные  различия, был  назван  геномным  импритингом  и изучался

в  ряде  работ, где  было  показано, что  для  нормального  развития

млекопитающих  требуется  наличие  мужского  генома.

Другая  статья  Илменсе  и Хоппе  имела ещё больший резонанс. Авторы

сообщили  о  пересадки  ядер  внутренней  клеточной  массы   бластулы  в

энуклеированные  зиготы  мышей и получения трёх  взрослых  особей  (двух

 самок  и  одного  самца), генетически  идентичной  донорской  линии

мышей. Введение  ядер-доноров  и  удаление  пронуклеусов  из  зиготы

проводили  за  один  приём, затем  реконструированные  яйцеклетки

культивировали  in  vitro   до  стадии  бластулы и пересаживали  в матку

самок. Из  16  пересаженных  бластул  три  развились  во  взрослые  особи.

В  следующей  работе  эти  же  авторы  использовали  в  качестве  доноров-

ядер  клетки  эмбрионов  ещё  более  поздней  стадии (семь  суток)  и

будто  бы  получили  трёх  половозрелых  мышей. Однако  никто  из

работающих  в том же  направлении не  смог  добиться  подобных

результатов, и  достоверность  результатов  Илменсе  и Хоппе  вновь была

поставлена  под сомнение.

МакГрат  и Солтер  показали, что ядра  8-клеточных зародышей и клеток

внутренней  клеточной  массы  бластулы  не  обеспечивают  развития  in

vitro  реконструированных  яйцеклеток  даже  до  стадии  морулы, которая

предшествует  стадии  бластулы. Наибольшая  часть  (5%) 4-клеточных

зародышей  даёт  возможность  развиваться  только  до  стадии  морулы. В

тоже  время  19%  реконструированных  яйцеклеток  2-ядерных  клеточных

зародышей, смогли  спокойно  достичь  стадии  морулы  или  бластулы.

Эти  и  другие  данные  показывают, что  в  эмбриогенезе  у  мышей

клеточное  ядро  рано  теряет  тотипотентность, что связано, очевидно, с

очень  ранней  активизацией  генома  зародыша – уже  на  стадиях  двух

клеток. У  других  млекопитающих, в  частности  у  кроликов, овец  и

крупного  рогатого  скота, активизация  первой  группы  генов  в

эмбриогенезе  происходит  позднее, на  8-16  клеточной стадии. Возможно,

поэтому  первые  значительные  успехи  в  клонировании  животных  были

достигнуты  на  других  видах млекопитающих, а не  на   мышах.

 

Тем  не  менее,  особый  интерес  вызывают  опыты  группы  учёных  из

университета  в  Гонолулу  во  главе  с  Риузо  Янагимачи. Авторам удалось

 усовершенствовать   метод  Уилмута, о котором речь  пойдёт  ниже, они

отказались  от  электрической  стимуляции  слияния  донорской  соматической

 клетки  с  яйцеклеткой   и изобрели  такую  микропипетку, с  помощью

которой  можно было  бы  безболезненно извлекать ядро  из  соматической

клетки  и  трансплантировать  его  в  обезъядренную  клетку. Кроме того,

авторы  использовали  в  качестве  донорских  относительно  менее

дифференцированные  ядра  клеток, окружающих  ооцит.  Наконец, удалось,

как  бы  синхронизировать  процессы, протекающие  в  яйцеклетке  и

трансплантируемом  в  нём  ядре, что  позволило  обеспечить  естественные

ядерно-цитолазматические  взаимоотношения между ядром и цитоплазмой,

поскольку  трансплантируемое  дифференцированное  в  определённом

направлении  ядро  и цитоплазма  яйцеклетки  до  того  работали  как бы

в  разных  режимах.

 

Авторы  использовали  для  трансплантации  ядра  клеток, окружающих  ооцит

(клеток  так  называемого  cumulus  oophorus), клеток  Сертоли  из

семенников  и  клеток, выделенных  из  мозга. Ядра, выделенные  из

соматических  клеток, инъецировали  в  энуклеированное  яйцо  с помощью

микропипетки. Яйцо  активировали  к  развитию, поместив  в  специальный

раствор  (так  называемый  HEPES-CZB), свободный  от  кальция, и  добавляя

стронций  и  цитохалазин.Стронций  активировал яйцо, а кальций подавлял

образование  полярных  телец. Эмбрионов  культивировали  до  стадии  2-8

клеток, морулы  или  бластулы, а  затем трансплантировали  в  матку

приёмной  матери, где  многие  из  них  имплантировались  и  некоторые  из

 них  (15-16%)  продолжали  своё  развитие. Процент  выхода  рождённых

мышат  (их  извлекали  с  помощью  кесарева  сечения  на  18, 5-19-й  дни

беременности)  был, однако, низок – в  разных  сериях  экспериментов  от  2

 до  2,8%. Молекулярные  исследования  доказали  принадлежность  ядер

рождённых  мышат  к  клеткам  донора  соматических  клеток.Таким  образом,

по  крайней  мере  в некоторых случаях доказана  способность ядер

соматических  клеток  обеспечивать  нормальное  развитие  млекопитающих.

 Тем не  менее,  работы  с  мышами, несмотря  на  их  непростую  судьбу,

значительно  расширили  наши  представления  о  методологии  млекопитающих.

 

 

                  Кролики  и  коровы.

Американские  исследователи  Стик  и Робл, используя метод Солтера  и

МакГрата, получили  шесть живых кроликов, пересадив ядра  8-клеточных

эмбрионов  одной  породы  в  лишённые  ядра  яйцеклетки  кроликов  другой

породы. Фенотип  родившихся  полностью соответствовал  фенотипу  донора.

Однако  только  6  из  164  реконструированных  яйцеклеток  (3,7%)