Лекция по "Биологии"

Основные  методы культивирования вирусов.

1.В организме лабораторных  животных.

2.В куриных эмбрионах.

3.В клеточных культурах  - основной метод.

Типы клеточных  культур.

1.Первичные (трипсинизированные) культуры- фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т.д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2.Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).

3.Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе- например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.

Специальные питательные среды для культур  клеток.

Используются разнообразные  синтетические вирусологические питательные  среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста- среда 199, Игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды  добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении  сыворотки крови (наиболее эффективной  считают эмбриональную телячью  сыворотку), L-цистеин и L-глютамин.

В зависимости от функционального  использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови) - их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием)- для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Выявляемые  проявления вирусной инфекции клеточных  культур.

1.Цитопатический эффект.

2.Выявление телец включений.

3. Выявление вирусов методом  флюоресцирующих антител (МФА), электронной  микроскопией, авторадиографией.

4.Цветная проба. Обычный  цвет  используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2)- красный. Размножение клеток меняет рН и соответственно- цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.

5.Выявление гемагглютинина  вирусов- гемадсорбция, гемагглютинация.

6.Метод бляшек (бляшкообразования). В результате цитолитического  действия многих вирусов на  клеточные культуры образуются  зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки- вирусные " клеточно- негативные" колонии.

Номенклатура  вирусов.

Название семейства вирусов  заканчивается на  "viridae", рода- "virus", для вида обычно используют специальные названия, например - вирус краснухи, вирус иммунодефицита человека- ВИЧ, вирус парагриппа человека типа 1 и т.д. 

 

Вирусы  бактерий (бактериофаги).

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам  присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется  наличием головки- икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто  имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т.е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов  с клеткой (бактерией) строго специфично, т.е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные  этапы взаимодействия фагов и  бактерий.

1.Адсорбция (взаимодействие  специфических рецепторов).

2.Внедрение вирусной ДНК  (инъекция фага) осуществляется за  счет лизирования веществами  типа лизоцима участка клеточной  стенки, сокращения чехла, вталкивания  стержня хвоста через цитоплазматическую  мембрану в клетку, впрыскивание  ДНК в цитоплазму.

3.Репродукция фага.

4.Выход дочерних популяций.

Основные  свойства фагов.

Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие редуктивную фаговую инфекцию (редукцию фага). В последнем случае геном фага в клетке не не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении. Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка- репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями- в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру  действия на бактерии фаги разделяют на :

- поливалентные (лизируют  близкородственные бактерии, например  сальмонеллы);

- моновалентные (лизируют  бактерии одного вида);

- типоспецифические (лизируют  только определенные фаговары  возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного  пятна при росте колоний) или  методом агаровых слоев (титрования по Грациа).

Практическое  использование бактериофагов.

1.Для идентификации (определение  фаготипа).

2.Для фагопрофилактики (купирование  вспышек).

3.Для фаготерапии (лечение  дисбактериозов).

4.Для оценки санитарного  состояния окружающей среды и  эпидемиологического анализа. 

 

Лекция № 6. Генетика бактерий и вирусов.

Молекулярная биология, изучающая  фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем  микробиологии. В качестве основных объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а основное направление- молекулярная генетика основана на генетике бактерий и фагов.

Бактерии- удобный материал для генетики. Их отличает:

- относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);

- гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;

- различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК;

- половая дифференциация  в виде донорских и реципиентных  клеток;

- легкость культивирования,  быстрота накопления биомасс.

Общие представления  о генетике.

Ген- уникальная структурная единица наследственности, носитель и хранитель жизни. Он имеет три фундаментальные функции.

1.Непрерывность наследственности- обеспечивается механизмом репликации ДНК.

2.Управление структурами и функциями организма - обеспечивается с помощью единого генетического кода из четырех оснований (А- аденин, Т- тимин, Г- гуанин, Ц- цитозин). Код триплетный, поскольку кодон- функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований (букв).

3.Эволюция организмов- благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

В узкоспециальном плане  ген чаще всего представляет структурную  единицу ДНК, расположение кодонов  в которой детерминирует первичную  структуру соответствующей полипептидной  цепи (белка). Хромосома состоит из особых функциональных единиц- оперонов.

Основные этапы развития (усложнения)  генетической системы можно представить в виде следующей схемы: