Нейропептиды

Наконец, НП шестнадцатого семейства  — эндозепины — являются негативными регуляторами рецепторов GABA. Если сама GABA является тормозным медиатором, участвующим в разнообразных процессах, в том числе в транквилизации — снижении тревожности, успокоении, то эндозепины, напротив, вызывают тревожность и проконфликтное поведение. По-видимому, подавление GABA-ергической трансмиссии, очень широко представленной в мозге, позволяет предполагать у эндозепинов и другие проявления биологической активности, но исследования этой группы НП начаты сравнительно недавно.

Пептиды - коннекторы

Описан целый ряд пептидов, так  называемых пептидов-коннекторов, которые  ряд исследователей считают непосредственными  детерминантами формирования определенных условных рефлексов и довольно сложных  навыков. Эту точку зрения разделяют  не все исследователи. Так некоторые  из них полагают, что пептиды-коннекторы являются не детерминантами памяти, а  регуляторами некоторых специфических  форм врожденного поведения животных. Пептиды-коннекторы представляют исключительный интерес. Наиболее изученными из них  являются амелитин, скотофобин, хромодиопсины и катабатмофобин. Все они получены из мозга животных, тренированных к тому или иному навыку. При введении в мозг они сообщают необученному животному тот же навык.

Амелитин, по-видимому, имеющий строение Глу-Глу-Гли-Тир-Сер-Лиз образуется в мозгу белых крыс при привыкании к резкому звуку определенной частоты и продолжительности. После введения амелитина, выделенного из этого животного, необученной крысе, она не реагирует на резкий звук той же частоты и продолжительности. Эффективная доза — 10 нг.

Скотофобин, вероятно, имеет следующее строение:

Сер-Асп-Асн-Асн-Глн-Глн-Гли-Лиз-Сер-Ала-Глн-Глн-Гли-Гли-Тир. Он образуется в мозгу белых крыс при воспитании у них страха перед темной частью лабиринта. После введения природного препарата белые крысы и мыши, а также рыбы избегают темноты.

Хромодиопсины образуются в мозгу золотых рыбок при выработке у них рефлексов избегания синей или зеленой стенки аквариума. Этот рефлекс передается необученным золотым рыбкам после введения им хромодиопсина. Химический состав хромодиопсинов не установлен. Хромодиопсин «к зеленому цвету» расщепляется трипсином и химотрипснном, а хромодиопсин «к синему цвету» устойчив к трипсину и расщепляется химотрипсином.

Катабатмофобин имеет молекулярный вес 1700—1950, образуется в мозгу белых крыс при формировании двигательно-оборонительного рефлекса избегания определенной последовательности движений. Введение катабатмофобина сообщает необученным белым крысам этот рефлекс. Механизм действия этой интереснейшей группы соединений пока неясен. После введения животному скотофобин преимущественно локализуется в коре. Высказывались предположения, что действие этих пептидов основано на специфическом связывании с определенными небольшими группами синапсов, надолго повышающем их проводимость (отсюда и термин—пептид-коннекторы). Для изучения этого класса пептидов требуется четкое установление их структуры.

Система регуляторных пептидов образует так называемый функциональный континуум. Это обозначает то, что, с одной  стороны, каждый из пептидов обладает уникальными свойствами, уникальным комплексом активностей. С другой стороны, многие проявления биоактивности каждого из пептидов совпадают или близки к таковым ряда других пептидов. В результате каждый пептид выступает как созданный эволюцией "пакет программ" для включения или модуляции определенного комплекса функций. Набор таких комплексов настолько велик, что создается возможность относительно плавного, непрерывного перехода от одного к другому комплексу совместимых функций. Представление о функциональном континууме пептидных регуляторов позволяет понять биологический смысл их необычайного многообразия. Указанное выше число уже открытых пептидных регуляторов, по-видимому, значительно меньше их действительной численности, если учесть, что каждый год приносит открытие не только ряда пептидов, относящихся к уже известным семействам, но и новых семейств пептидов.

Кроме обеспечения разнообразнейших комплексов биоактивностей пептидный континуум выполняет ещё одну функцию — образование сложных регуляторных цепей и каскадов. Каждый из НП обладает способностью индуцировать выход в кровь, в цереброспинальную жидкость, в межклеточные среды организма определенных НП. Частным случаем этой системы взаимной индукции является описанное действие либеринов и статинов гипоталамуса на выход гормонов гипофиза. Каждый НП, выход которого индуцирован другим пептидом, в свою очередь может индуцировать выход ряда следующих НП, так что возникает цепной, каскадный регуляторный процесс. Сейчас трудно судить о том, сколь длинной может быть такая цепь. Известно, однако, что многие НП, период полуэллиминации которых измеряется минутами, способны вызывать многочасовые и даже многосуточные эффекты после введения в организм, Вероятно, основой этого и являются такие цепные процессы. Биологический смысл существования длительных регуляторных процессов, складывающихся из кратковременных звеньев, очевиден. В отличие от систем, основанных на долгоживущих регуляторах, такая система является более гибкой в меняющейся ситуации, при поступлении новых сигналов и т.п.

В сложной системе индуцирующего  действия НП на выход других НП необходимо отметить ряд элементов иерархии, "взаимоподчинения" одних регуляторов другим. Например, ВИП и ХЦК-8, локализованные в значительных количествах в коре головного мозга, способны индуцировать или тормозить выход ряда либеринов и статинов гипоталамуса, который, в свою очередь, регулирует выход гормонов гипофиза. Многие из последних тоже служат индукторами выхода периферических гормонов (щитовидной железы, надпочечников и др.). Такая иерархия, контроль и управление "сверху-вниз" сочетается со сложной системой прямых действий всех НП на многие функции организма.

Сколь бы сложной ни представлялась эта картина действия и взаимодействия пептидов, следует постоянно помнить  о существовании диалектического  сочетания их прямых и опосредствованных  каскадных эффектов. 

Процессинг и посттрансляционная модификация нейропептидов

Общий принцип синтеза всех достаточно изученных НП состоит в образовании  относительно больших пептидов-предшественников, из которых после завершения трансляции выщепляются протеазами соответствующие НП. Как правило, в состав пептида-предшественника входит одна или большее число последовательностей НП (иногда весьма различных по структуре) и так называемая сигнальная последовательность, способствующая миграции предшественника внутри клетки после завершения трансляции в шероховатой эндоплазматической сети и отщепляемая в конце этой части пути.

В 1984 году Gainer сформулировали гипотезу секреторных везикул, согласно которой процессинг биологически активных пептидов осуществляется в процессе передвижения молекул пропептидов по гранулярному ЭПР, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах. Последние содержат полный набор ферментов процессинга, специфичный для данной клетки (ткани), а также специальные системы поддержки оптимальной рН среды.

Процессинг нейропептидов внутри секреторных гранул включает в себя эндо- и экзопротеолитические реакции, а также гликолизирование, сульфатирование, амидирование и фосфорилирование N- и С-концевых аминокислотных остатков, что предохраняет образовавшийся продукт от дальнейшей деградации.

Многие пептиды-предшественники  образуют промежуточное соединение с гликозидами, которые оказывают  стабилизирующее действие на некоторых  стадиях процессинга и влияют на выбор мест атаки протеиназами. Протеиназы, обеспечивающие выщепление НП в течение нескольких десятков минут — часа после трансляции, не являются высокоспецифичными. В значительной мере точное выщепление обусловлено наличием в последовательности аминокислот пептидов-предшественников парных остатков. Они в первую очередь атакуются протеиназами, близкими по характеру действия к катепсину В и трипсину. Выщепляемые в этой фазе процессинга фрагменты во многих случаях уже представляют собой активные НП. Нередко эти фрагменты подвергаются дальнейшему протеолизу опять-таки с образованием новых НП. На этой фазе описано участие не только трипсиноподобных протеиназ, но и ряда других протеиназ, специфичность которых тоже не является очень высокой. Однако в различных нейронах и, возможно, даже в разных терминалях одного нейрона их набор может быть неодинаковым, что обеспечивает в конечном счете ту или иную специализацию на продукции строго определенных НП (единичных или их комплексов).

Так например, многие эндопептидазы, участвующие в процессинге энкефалинов обладают очень узкой субстратной специфичностью. Так, эндопептидаза, специфичная к связи Lys-Arg, не расщепляет связи Arg-Arg и Arg-Lys, что объясняют специфичностью фермента не только к гидролизуемой связи, но и, вероятно, к ближайшему аминокислотному окружению. Расщепление может происходить иногда не по парам остатков основных аминокислот, а по моноостаткам аргинина, лизина или каких-либо других аминокислот. Например, тиоловая прогормон-конвертаза расщепляет предшествен-ники энкефалинов с обеих сторон по моно- и диосновным остаткам аминокислот, но более высокую специфичность проявляет к моноосновным сайтам. Все этапы процессинга хорошо иллюстрируются схемой превращений проопиомеланокортина, из которого могут формироваться β-липотропин, АКТГ1-39, АКТГ1-24, АКТГ18-39 (так называемый CLIP), α, β- и γ-МSH, β-, γ- и α-эндорфины, Met-энкефалин, дезтирозильные производные эндорфинов, С-концевой дипептид β-эндорфина и, возможно, еще некоторые другие НП. Еще раз подчеркнем, что имеется в виду не одновременное образование всех этих НП в одном нейроне или терминали, а более или менее избирательное формирование их в зависимости от набора протеаз в данной клетке.

Обращает на себя внимание, что  синтез ряда опиоидных пептидов, содержащих в качестве минимальной активной последовательности Met-энкефалин, обеспечивается по крайней мере двумя пептидами-предшественниками — проопиомеланокортином (локализованным главным образом, но не исключительно в гипофизе) и препроэнкефалином А (локализованным преимущественно, но опять-таки не исключительно в надпочечниках). Сходным образом лей-энкефалинсодержащие опиоидные НП выщепляются из мозгового пептида-предшественника продинорфина (препроэнкефалина В) и из уже упоминавшегося препроэнкефалина А, совмещающего в себе последовательности НП с лей-энкефалиновыми и мет-энкефалиновыми активными центрами. Однако общность минимальных последовательностей опиоидных НП, заключенных в разных пептидах-предшественниках, не означает идентичности содержащих их НП большого размера: продинорфин образует лей-морфин и перекрывающийся с ним каскад динорфинов разного размера (динорфин В (риморфин) и 4кД-ди-норфин), а также α- и β-неоэндорфины. Из препроэнкефалина А формируются самостоятельные НП, содержащие и лей-энкефалин, и мет-энкефалин (например так называемый пептид Е).

Сходные закономерности структуры  можно отметить и для некоторых  других пептидов-предшественников, хотя они, как правило, исследованы в  гораздо меньшей степени, чем  предшественники опиоидов, АКТГ и МСГ. Можно полагать, что дальнейший анализ биологической активности их фрагментов позволит выявить источники новых НП.

Обращают на себя внимание большие  области пептидов-предшественников, где пока не идентифицированы НП. Хотя часть из них выполняет (судя по β  -эндорфину, АКТГ) функции дополнительных "адресных" последовательностей, уточняющих взаимодействие НП преимущественно с определенной тканью иди органом, есть основания предполагать и в них наличие последовательностей еще не идентифицированных НП. В ряде случаев образование НП и процессы их распада переплетаются друг с другом. Например, один из путей распада β-эндорфина - НП, имеющего самостоятельное функциональное значение, ведет, как уже упоминалось, к образованию γ-эндорфина и опять-таки НП, имеющего уникальную функциональную характеристику; отщепление концевого аминокислотного остатка от γ -эндорфина приводит к образованию α-эндорфина, весьма своеобразного по функциям, и т.д. 

Регуляция метаболизма активных регуляторных пептидов определяется большим спектром воздействий, изменяющих гомеостаз  на любом уровне - уровне клетки (транскрипция, трансляция и посттрансляционный процессинг), ткани (секреция и инактивация нейропептидов), а также на уровне организма в целом. Именно эти морфогенетические и биохимические особенности биогенеза и определяют уровень активных регуляторных пептидов в организме. При этом, несомненно, важная регулирующая роль в метаболизме нейропептидов принадлежит протеолитическим ферментам.

Метаболизм энкефалинов и ферменты их процессинга

Как было отмечено выше, известны три  белковые молекулы, включающие в свою структуру последовательности энкефалинов: проопиомеланокортин, препроэнкефалин А (проэнкефалин), препроэнкефалин В (продинорфин). Последовательности, определяющие структуру энкефалина, входящего в состав молекулы предшественника, фланкированы парами основных аминокислот - аргинина или лизина. Структуры типа Arg-Lys, Arg-Arg, Lys-Lys, Lys-Arg узнаются ферментативными комплексами, осуществляющими протеолиз. В результате действия как эндо-, так и экзопептидаз секреторных везикул, так и внеклеточных ферментов, локализованных на внешней поверхности мембраны и в биологических жидкостях организма, происходит полное освобождение активного пептида из его предшественника.

Протеолитические ферменты являются специфичными на каждом этапе процессинга. Выделяют множество различных везикулярных эндопептидаз, осуществляющих специфическое ращепление: прогормон-конвертазы 1/3 и 2, динорфин-превращающий фермент, тиоловая прогормон-конвертаза, энкефалинобразующий фермент, IRCM-сериновая протеиназа I. Ряд внеклеточных ферментов также принимают участие в процессинге энкефалинов: эндопептидаза 24.15 (КФ 3.4.24.15), эндоолигопептидаза А (КФ 3.4.22.19), а также ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, КФ 3.4.15.1), проявляющий наряду с эндопептидазной и дипептидилкарбоксипептидазную активность.