Полимеразной цепной реакции

2.4 Эффект "плато" 

Следует заметить, что процесс накопления специфических  продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность  критически падает. Это связано с  так называемым эффектом "плато". 

Термин эффект “плато” используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации. 

В зависимости  от условий и количества циклов реакции  амплификации, на момент достижения эффекта  “плато” влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации. 

Чем меньше начальная  концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на “плато". Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов  амплификации будет достаточно, чтобы  их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы. 

3. Cтадии  постановки ПЦР 

3.1 Подготовка пробы  биологического материала 

Для выделения  ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР. 

Стандартной и  ставшей уже классической считается  методика получения чистого препарата  ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ. 

Одним из популярных в настоящее время является метод  выделения ДНК, предложенный Boom с  соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина  тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. 

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца. 

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки  следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов. 

3.2 Амплификация 

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить  реакционную смесь и внести в  нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые  особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом  биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза. 

3.3 Оценка результатов реакции 

Для правильной оценки результатов ПЦР важно  понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул  ДНК-мишени могут быть обнаружены с  помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует. 
 
 
 
 
 
 
 

3.3.1 Метод горизонтального  электрофореза 

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод  электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 - 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм). 

Яркость полос  продуктов амплификации может быть различной. Однако это нельзя связывать  с начальным количеством ДНК-мишени в образце. 

3.3.2 Метод вертикального  электрофореза 

Метод вертикального  электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что  в данном случае вместо агарозы используют полиакриламидные гели. Его проводят в специальной камере для вертикального  электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в обычной работе используют метод горизонтального электрофореза. 

3.4 Контроль за прохождением реакции амплификации 

3.4.1 Положительные контроли 

В качестве "положительного контроля" используют препарат ДНК  искомого микроорганизма. Неспецифические  ампликоны отличаются по размеру  от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Размер неспецифических продуктов может быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные. 

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды (участки ДНК, расположенные внутри амплифицируемой последовательности), меченные ферментными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующими с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры. Это значительно усложняет и удлиняет анализ, а его стоимость существенно увеличивается. 

3.4.2 Внутренние контроли 

Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели используют дополнительный, так называемый "внутренний контроль". Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК. 

К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контролем за праймеры. Это особенно принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам. 

Тем не менее, при  условии решения проблемы конкуренции  за праймеры, этот способ контроля эффективности  амплификации безусловно будет весьма полезен. 

4. Методы, основанные  на полимеразной  цепной реакции

4.1 Качественный анализ 

Классический  способ постановки ПЦР, принципы которого были изложены выше, нашел свое развитие в некоторых модификациях, направленных на преодоление ограничений ПЦР  и повышение эффективности прохождения  реакции. 

4.1.1 Способ постановки  ПЦР с использованием “горячего старта" 

Чтобы уменьшить  риск образования неспецифических  продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт" (“Hot-start”). Суть его  состоит в предотвращении возможности  начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. 

Дело в том, что в зависимости от ГЦ-состава  и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура  системы превышает Тm, праймер  не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции. 

Существуют различные  варианты реализации "горячего старта": 

Внесение в  реакционную смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после  прогрева пробирки до температуры денатурации. 

Разделение ингредиентов реакционной смеси парафиновой  прослойкой на слои (в нижней части - праймеры, в верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые смешиваются при расплавлении парафина (~65-750С). 

Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными  антителами, становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда моноклональные антитела необратимо денатурируют и освобождают активные центры Taq-полимеразы. 

Во всех перечисленных  случаях, даже если неспецифический  отжиг произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.