Стерилизация питательных сред, способы культивирования, выделение, очистка и концентрирование продуктов метаболита

Продукты  микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ.  В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты, представляющие практическую ценность.  Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от природы продуцента. При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осаждается добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно - физическое осаждение. Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал, внутриклеточные биополимеры)  возможно и методом фильтрации. Так как фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру.  Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.  Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.  Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например, интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы. К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с последующим резким снижением давления).  Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Культуральную жидкость освобождают от сопутствующих растворимых веществ и фракционируют.  Освобождение от растворимых веществ производят несколькими способами:

1. Осаждение – физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ).  Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает 80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.  Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.

2. Экстракция.  При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями.

3. Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент – твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму.

Более тонкую очистку веществ  осуществляют несколькими  способами.    Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта). По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул. Можно разделять молекулы методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их: заряду (ионообменная хроматография), гидрофобности (гидрофобная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография). При ионообменной хроматографии нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы: диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно; карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и рН элюирующего раствора. Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи; в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками. Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза).  Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров. Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок.

  Концентрирование продукта

За отделением продукта следует его концентрирование. Основные методы концентрирования —  обратный осмос, ультрафильтрация, выпаривание. Если мембрана пропускает воду, задерживая растворенные в ней вещества, речь идет об осмосе. Прямой осмос — диффузия веществ через мембрану, разделяющую  раствор и растворитель. Как правило, раствор помещают в мешок из полупроницаемого материала, и этот мешок погружают в сосуд с растворителем. Растворитель, поступающий извне, оказывает на мешок давление, называемое осмотическим. Если к раствору приложить внешнее давление, превышающее осмотическое, то растворитель вытекает через полупроницаемую мембрану против градиента концентрации растворенного вещества, т. е. происходит дальнейшее концентрирование раствора. Подобный процесс представляет собой обратный осмос, используемый как метод концентрирования продукта. Ультрафильтрация — отделение веществ с помощью мембранных фильтров. Некоторые марки фильтров предназначены для отделения лишь сравнительно крупных частиц: иммуноглобулинов, коллоидных агрегатов, вирусов. Мембраны с наиболее мелкими порами задерживают молекулы органических кислот. При умеренно высоком давлении (200—400 кПа), приложенном к жидкости, скорость ее протока через фильтр достаточно высока для быстрой и эффективной ультрафильтрации. Технология ультрафильтрации подкупает своей простотой, относительной экономичностью и мягким, щадящим обращением с продуктом. Здесь не требуется изменения рН, ионной силы раствора или перевода продукта в другую фазу. Этим объясняется перспективность ультрафильтрации для концентрирования таких малостабильных продуктов, как молочная и глутаминовая кислоты, некоторые антибиотики и ферменты, витамин В12. Метод выпаривания, наиболее древний и известный еще алхимикам, обладает очевидным недостатком: для удаления воды или иного растворителя раствор необходимо нагревать. В производственных условиях чаще используют вакуум-выпарные аппараты, и температура выпаривания, соответственно и вред, причиняемый термолабильным веществам, могут быть снижены в зависимости от уровня снижения давления в выпарном аппарате по сравнению с атмосферным. Нагревающим агентом чаще всего служит водяной пар, хотя используют также обогрев жидким теплоносителем или электрообогрев. Пар характеризуется большой теплотой конденсации и облегчает регулировку процесса выпаривания. Выпарные аппараты бывают периодически и непрырывно действующие, с однократной и многократной циркуляцией кипящего раствора. Теплообмен между нагревающим агентом и выпариваемым раствором обеспечивается системой труб, змеевиков или паровой рубашкой. Необходимо добиваться равномерного обогрева раствора без локального перегрева. Перспективные методы выпаривания чувствительных к нагреванию веществ состоят в использовании дисковых и пленочных выпарных аппаратов, в которых испарение стимулируется в результате растекания жидкости тонким слоем по нагретой поверхности. Выпаривание может быть ограничено стадией получения густого сиропообразного раствора целевого продукта. В этом случае вся процедура называется упариванием, а полученный продукт относится к категории жидких. Исчерпывающее удаление влаги, оставшейся после упаривания, обратного осмоса, ультрафильтрации, ведет к получению «сухого продукта» и выделяется технологами в особую стадию -~ обезвоживание продукта (сушка). Обезвоживание продукта. В распоряжении биотехнолога имеются различные методы сушки. Их выбор зависит от физико-химических свойств обезвоживаемого продукта, в частности, от вязкости раствора и от стабильности или жизнеспособности при повышенных температурах, если речь идет о живых объектах. Наиболее старым методом можно считать сушку на подносах. Для сушки термостабильных антибиотиков и аминокислот применяют модификацию метода — ленточную сущку. Подносы в этом случае заменяют на ленточный конвейер, ленту постоянно подогревают. Газообразный нагревательный агент (пар, воздух, СО₂, дымовые или топочные газы) мощной струей врывается в сушильный аппарат снизу, и частицы обезвоживаемого продукта парят в газовом потоке. Принципиально аппарат совпадает с газофазным биореактором. Преимуществом метода является возможность регулирования в широких пределах продолжительности пребывания материала в аппарате, интенсивности массопередачи и теплообмена, возможность организовать непрерывный процесс при простой конструкции аппарата. Ограничение метода состоит в том, что материал не должен приставать к стенкам сушильного аппарата. Метод пригоден для сушки антибиотиков, аминокислот, крахмала, но не суспензий клеток. Барабанные сушилки, в которых обезвоживают микробные суспензии, состоят из вращающихся подогреваемых барабанов, погруженных в сосуд с суспензией. Соприкасаясь с барабаном, суспензия обезвоживается и присыхает в виде пленки к его стенкам. Высохшую биомассу соскребают со стенок ножом. Разрабатываются низкотемпературные режимы сушки, для эффективного осуществления которых необходимо тщательно удалять влагу из газа-теплоносителя и обеспечить тонкодисперсное распыление исходной суспензии. Другой проблемой, присущей методу распылительной сушки, является налипание продукта на стенки сушильной камеры. Капли суспензии или раствора достигают стенок камеры раньше, чем успевают подсохнуть. Налипание влажных частиц на стенки вызывает нарушение стабильной работы всего сушильного аппарата. Предлагается понижать вязкость исходной суспензии (раствора), что достигается путем нагревания, уменьшения в ней содержания веществ и установки оптимального рН. Каждый из этих способов понижения вязкости не лишен, однако, своих проблем. Например, повышение температуры вызывает угрозу инактивации целевого продукта. Полученный сухой продукт поступает на хранение после придания ему товарного вида.