Терапия стволовыми клетками

Таким образом, иммунология стволовых клеток является важным разделом биологии стволовых клеток. Особый интерес здесь вызывают иммунологические реакции, вызываемые введением аллогенного трансплантанта стволовых клеток, и определение антигенных маркеров различных типов стволовых клеток.

11. Генетика стволовых клеток

11.1.Ремоделирование хроматина

Биология стволовых клеток было в последнее время качественно изменилась. Дифференциация стволовых клеток (гемопоэтических и негемопоэтических) рассматривалась иерархичной по природе, но последние данные заставляют предположить, что не существует иерархии клетка-прогенитор/стволовая клетка, но скорее обратимый континуум. Фенотип стволовых клеток (гемопоэтический и негемопоэтический), общая способность к дифференцировке (гемопоэтической и негемопоэтической), экспрессия генов, так же, как другие функциональные характеристики (хоуминг, экспрессия рецепторов и молекул адгезии) варьируют в течение клеточного цикла весьма широко. Это представляется зависимым от изменений в хроматине и экспресии генов по мере прохождения клеточного цикла. Опубликованные данные по ДНК метилированию, ацетилированию гистонов и также и РНК, главных регуляторов активности генов, сочетаются очень хорошо и дают объяснение этих главных событий биологии стволовых клеток. Эти черты стволовых клеток, упомянутые выше, довольно трудно понять с точки зрения классической иерархической биологии, но они становятся понятными, когда проводится корреляция с лежащими в их основе эпигенетическими изменениями. Происходит вступление в новую эру биологии стволовых клеток - эру “хроматиномики” /11/.

Таким образом, основные события в биологии стволовых клеток связаны с изменениями в хроматине. Возникла новая наука - хроматиномика.

11.2 Самообновление стволовых клеток

Гематопоэтичесие стволовые клети самообновляются в течение всей жизни, но нет точного понимания молекулярных механизмов этого процесса и его регуляции. На основании исследований об оверэкспрессии и нокаута, были описаны гены, влияющие на самообновление стволовых клеток, включая транскрипционные факторы, регуляторы клеточного цикла и гены, влияющие на структуру хромосом. Представлена модель, в которой эти отдельные классы молекулярных регуляторов интегрированы. Она сфокусирована на роли G1/S последовательности в развитии переключений по направлению самовозобновления стволовых клеток против дифференцировки. Экспериментальное изучение этой модели и других родственных гипотез может повести к более полному описанию самовозобновления гемопоэтических клеток и его регуляции, как в нормальных физиологических процессах, так и при прикладных терапиях /56/.

Способность к поддержанию и самовосстановлению - генерации дочерних клеток, имеющих такие же регенеративные свойства, как и родительские клетки - является определяющей чертой гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Существует убедительные доказательства того, что самообновление находится под внешним биологическим контролем in vivo. Разнообразные цитокины, морфогенетические лиганды и ассоциированные сигнальные компоненты влияют на самообновление в культуре и in vivo. Специфические транскрипционные факторы действуют, как сильные внешние агонисты самообновления ГСК in vitro и in vivo, когда на них действуют либо трансдуцированные ДНК, либо введенные извне белки. Эти открытия углубляют знание механизмов и пригодны для расширения достижений клинически полезных уровней ГСК /49/.

Все зрелые клетки крови происходят из небольшой популяции самообновлящихся плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток. Способность к самообновлению характеризует все стволовые клетки, как нормальные, так и неопластические. Интересно, что согласно новейшим исследованиям самообновления важно для поддержания существования опухолевых клеток, что предполагает значение этого процесса для терапии. К сожалению, молекулярные основы самообновления у клеток позвоночных пока еще слабо определены /31/.

Таким образом, существуют гены, влияющие на самообновление стволовых клеток, включая транскрипционные факторы, регуляторы клеточного цикла и гены, влияющие на структуру хромосом. Разнообразные цитокины, морфогенетические лиганды и ассоциированные сигнальные компоненты влияют на самообновление в культуре и in vivo

11.3 Дифференцировка стволовых клеток

Относительный состав оснований ДНК регуляторных последовательностей недетерминированных полипотентных родоначальных клеток может иметь значение для частоты транскрипции этих генов при клеточной дифференцировке. Последовательности этих регуляторных областей генов клеточной детерминации, которые обогащены А-Т, создают потенциал для транскрипции из-за их более низко температуры плавления и склонности к связыванию. Одна или несколько групп высокой мобильности хроматиновых белков преимущественно связываются с богатыми АТ регуляторными последовательностями, что приводит к увеличению уровня транскрипции. Нефосфорилированные гистоны, реагирующие с теми же регуляторными сайтами, могут увеличивать частоту транскрипции. Уровень клеточного роста, т.е. суммарный белковый синтез клетки позитивно коррелирует с синтезом белков хроматина высокой мобильности. Синтез гистонов H1 связан с репликацией ДНК. Несбалнсированный рост изменяет количество белков высокой мобильности и H1 гистонов, таким образом, изменяя уровень транскрипции. Чем больше обогащение АТ последовательностями регуляторных областей генов клеточной детерминации, тем в большей степени АТ - обогащенные регуляторные последовательности ответственны за раннюю экспрессию генов клеточной детерминации в течение эмбрионального развития. Преимущественное связывание H1 гистонов с более АТ - обогащенными регуляторными последовательностями ограничивает их транскрипцию по сравнению с генами клеточной детерминации /20/.

Представлена контролируемая компьютером цейтраферная система для изображения культивируемых гемопоэтических клеток, меченных для экспрессии различных флуоресцирующих белков. Во-первых, описаны эксперименты по оптимизации визуализации трех вариантов зеленых флуоресцирующих белков (циан-, зеленый и желтый усовершенствованный флуоресцентный белок) и красный флуоресцентный белок (DsRed) с помощью стандартной с широкой областью регистрации флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, описаны процедуры для лучшего распознавания комбинаций клеток, экспрессирующих эти белки, с использованием семи коммерчески доступных комплектов фильтров, основанные на относительных интенсивностях флуоресценции индивидуальных флуоресцентных белков. Даны рекомендации о том, какие из этих фильтров выбирать при работе со специфическими флуоресцентными белками /55/.

Существуют большие генетически детерминированные количественные вариации в числе и функции гемопоэтических стволовых клеток в инбредных линиях мышей. Более того, старение гемопоэтических клеток генетически детерминировано. Генная идентификация в характерных локусах (местоположениях), участвующих в регуляции и старении гематопоэтических стволовых клеток обеспечит новые инсайты в регуляторные механизмы, которые имеют значение in vivo и могут быть клинически важны. Описаны стратегии для картирования и идентификации генов характерных локусов, которые участвуют в регуляцию гематопоэтических стволовых клеток /52/.

Восстановление тканей - это процесс, когда множество поврежденных типов клеток замещается для восстановления гистоархетоктоники и функции ткани. Несколько теорий было предложено для объяснения феномена тканевого восстановления у амфибий и животных, относящихся к высшим классам. Эти теории включают дифференциацию поврежденных тканей, трасдифференцировку входящих в клон клеток - предшественниц и активацию резервных клеток-предшественниц. Исследования Young et al. и других показали, что компартменты соединительной ткани во все время постнатального развития содержат резервные клетки - предшественницы. Последовательное повторяющееся одноклеточное клонирование и исследования по сортировке клеток выявили, что эти резервные клетки - предшественницы состоят из множественных популяций клеток, включающих тканево-специфичные клетки - предшественницы, зародышевый слой потомства стволовых клеток и плюрипотентные стволовые клетки. Тканево-специфичные клетки - предшественницы демонстрируют различные способности к дифференцировке, от унипотентности (образуя один клеточный тип) до полипотентности (образуя множественные клеточные типы). Однако, все клетки - предшественницы демонстрируют конечную продолжительность жизни от 50 до 70 удвоений популяции перед программируемыми старением и смертью. Линия зародышевого слоя стволовых клеток может образовывать более широкое разнообразие клеточных типов, чем клетки - предшественницы. Индивидуальная стволовая клетка зародышевой линии может образовывать все соответствующие клетки линии зародышевого слоя (т.е. эктодерму, мезодерму или эндодерму). Плюрипотентные стволовые клетки могут давать большее разнообразие клеточных типов, чем единственная стволовая клетка зародышевой линии. Единственная плюрипотентная стволовая клетка может образовывать клетки, принадлежащие всем трем линиям зародышевых слоев. Как стволовые клетки линии зародышевого слоя, так и плюрипотентные стволовые клетки демонстрируют повышенные способности к самообновлению, далеко превосходящие продолжительность жизни клеток - предшественниц (50-70 удвоений популяции) Авторы предполагают, что активация покоящихся тканевоспецифичных клеток - предшественниц, стволовых клеток линии зародышевого слоя и/или плюрипотентных стволовых клеток может послужить потенциальным объяснением, совместно с дедифференцировкой и трансдифференцировкой процесса восстановления тканей. Сегодня исследуются несколько модельных систем для определения возможностей использования взрослых покоящихся резервных клеток - предшественниц для тканевой инженерии /62/.

Таким образом, уровень клеточного роста, т.е. суммарный белковый синтез клетки позитивно коррелирует с синтезом белков хроматина высокой мобильности. Синтез гистонов H1 связан с репликацией ДНК. Несколько теорий было предложено для объяснения феномена тканевого восстановления у амфибий и животных, относящихся к высшим классам. Эти теории включают дифференциацию поврежденных тканей, трасдифференцировку входящих в клон клеток - предшественниц и активацию резервных клеток-предшественниц.

11.4 Фармакогеномика

Терапевтическое применение стволовых клеток представляет новый подход к лечению нескольких генетических и дегенеративных болезней. Возникновение фармакогенетики обещает оптимальный индивидуализированный лечебный режим для широкого разнообразия медицинских условий. Это создает новую нишу в терапевтическом медицинском исследовании, фармакогеномику. Развитие этого направления требует применения существующих технологий геномики, протеомики и биоинформатики к решению различных проблем, связанных с терапевтическими применениями стволовых клеток. /2/.

Таким образом, на базе фармагенетики создано новое направление - фармагеномика.

11.5 Ассимитричное деление стволовых клеток

Стволовые клетки получили особенно большое значение в течение последних лет, поскольку они представляют возможные инструменты для восстановления поврежденных органов. Эти клетки найдены не только в основных регенерирующих тканях, таких, как эпителий и кровь, но также в статических тканях, таких, как нервная система и печень, где они играют центральную роль в тканевом росте и сохранении. Механизм, с помощью которого стволовые клетки поддерживают популяции высоко дифференцированных короткоживущих клеток, как кажется, включает критический баланс между альтернативными путями (судьбами): дочерние клетки либо сохраняют идентичность стволовых клеток, либо инициируют дифференциацию. Недавние исследования на низших организмах выявили регуляторный механизм ассиметричных клеточных делений стволовых клеток. В этих моделях окружение, вероятно, обеспечивает ключевые инструктивные сигналы для выбора судьбы клеток. Наше понимание сейчас распространяется на внутренние механизмы клеточной полярности, которая влияет на ассиметричные деления стволовых клеток /18/.

Таким образом, судьба стволовых клеток, т.е. сохранение ими идентичности стволовых клеток или инициация дифференцировки решается в ходе ассиметричного клеточного деления у низших организмов.

11.6 Генная терапия и стволовые клетки

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются клоногенными, негемопоэтическими стволовыми клетками, присутствующими в костном мозге, и они способны дифференцироваться во множественные мезодерального типа клеточные линии, например, остеобласты, хондроциты, эндотелиальные клетки и также немезодермального типа линии, например, нейроноподобные клетки. Несколько методов сейчас доступно для изоляции МСК, основанные на их физических и физико-химических характеристиках, например, сцеплению с пластмассами или другими внеклеточными матриксными компонентами. Из-за легкости их изоляции и их большого потенциала дифференцировки, МСК находились среди первых стволовых клеток, использовавшихся в клинике. Несколько исследований продемонстрировали возможное использование МСК в систематической трансплантации для системных болезней, локальной трансплантации для локальных тканевых дефектов, и как переносчик генов в протоколах генной терапии или для генерации транплантабельных тканей и органов в протоколах тканевого инжиниринга. Перед тем, как широко использовать их в терапии, должны быть созданы методы, позволяющие генерировать большое число клеток, не влияющие на их потенциал дифференцировки, так же, как технологии, позволяющие преодолевать иммунологическое отторжение (в случае аллогенных трансплантантов) /26/.

Последние исследования показали, что продолжительность жизни мезенхимальных стволовых клеток span может быть увеличена путем увеличения уровней экспрессии теломеразы в клетках, и тем позволяя культуре накопить большее число клеток, необходимых для терапии. Дополнительно, было показано, что, возможно, культивировать клетки в ксено - окружении без влияния на их рост и потенциал дифференцировки. В заключение, мезенхимальные стволовые клетки кажутся гипоиммуногенными, и поэтому аллогенный трансплантант из мезенхимальных стволовых клеток возможен /27/.

В последние две декады способность переносить гены в ГСК обеспечила новые инсайты в поведение индивидуальных стволовых клеток и послужила основой новых подходов к лечению различных наследственных или приобретенных заболеваний. В настоящее время перенос в ГСК был достигнут в основном с помощью модифицированных ретровирусов. В то время как основанные на ретровирусах векторы могут эффективно трансдуцировать мышиные ГСК, экстраполяция этих методов к большим млекопитающим и человеку показала в клинических испытаниях, что они ведут к очень небольшому числу маркированных генами приживленных клеток. Дополнительно, оценки in vitro с помощью прогениторных клеток были найдены обладающими низкой предсказательной силой по отношению к исходу переноса генов в стволовые клетки. Внимание быстро переместилось к развитию превосходящих и более информативных преклинических анализов в исследовании переноса генов в человеческие стволовые клетки. Ксеногенные трансплантационные модели и системы трансплантации у больших млекопитающих оказались бесценны. Развитие лучших методов для оценки протоколов человеческой генной терапии и лучшего понимания стволовых клеток и векторной биологии нашло свою кульминацию в последнем десятилетии во множественных стратегиях для улучшения эффективности переноса генов ГСК. Улучшенные векторы переноса генов, оптимизация комбинации цитокинов и включение рекомбинантных фрагментов фибронектина в течение трансдуции являются примерами новых успешных добавлений к ранним протоколам переноса, которые внесли вклад в первый несомненные клинические выгоды от генетического манипулирования с ГСК /30/.