Отчет по патентному поиску

Настоящее изобретение  относится к биотехнологии. Описано  толерантное к стрессу растение пшеницы, где указанное растение пшеницы трансформировано молекулой  нуклеиновой кислоты, которая кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ). Раскрыт  способ защиты растения пшеницы от стресса, включающий стадию введения молекулы нуклеиновой кислоты в растение пшеницы, где молекула нуклеиновой  кислоты кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ). Представлена конструкция нуклеиновой  кислоты, включающая промотор, выделенный из растения, и ген орнитинаминотрансферазы (ОАТ), где указанная конструкция  способна трансформировать растение пшеницы  таким образом, что указанное  растение пшеницы становится толерантным  к стрессу. Раскрыт способ получения трансгенного растения пшеницы с индуцируемой или повышенной толерантностью к соли, включающий трансформацию растительной ткани или клетки растения пшеницы молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ), регенерацию ткани или клетки в целое растение и экспрессию ОАТ в регенерированном растении в течение времени и в условиях, достаточных для индукции или повышения толерантности растения к концентрации соли более чем 100 мМ. Изобретение позволяет получать устойчивое к стрессу растение. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, .

Данная заявка основана и притязает на приоритет  предварительной заявки на патент Австралии 2004904326, поданной 3 августа 2004.

Область техники, к которой  относится изобретение

Настоящее изобретение  относится к трансгенным растениям  пшеницы. В частности, настоящее  изобретение относится к трансгенному растению пшеницы с повышенной толерантностью к стрессу окружающей среды, такому как солевой стресс.

Сущность  изобретения

Заявители с  удивлением установили, что введение в растение пшеницы молекулы нуклеиновой  кислоты, кодирующей орнитинаминотрансферазу (ОАТ), обеспечивает трансгенное растение пшеницы индуцируемой или повышенной толерантностью к стрессу. Соответственно, в его самой общей форме  изобретение, раскрытое здесь, обеспечивает толерантное к стрессу растение пшеницы и способ защиты указанных  растений. В способе используется молекула нуклеиновой кислоты, которая  кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ).

В первом аспекте  настоящее изобретение относится  к толерантному к стрессу растению пшеницы, где указанное растение пшеницы трасформировано молекулой  нуклеиновой кислоты, которая кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ).

Во втором аспекте настоящее изобретение  относится к способу защиты растения пшеницы от стресса, включающему  стадию введения молекулы нуклеиновой  кислоты в растение пшеницы, где  данная молекула нуклеиновой кислоты  кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ).

В одном варианте осуществления стресс выбран из группы, состоящей из засухи, соли, обезвоживания, жары, холода, заморозков, избытка воды, повреждения, механического стресса, окислительного стресса, озона, высокой  освещенности, тяжелых металлов, отсутствия питательных веществ и токсических  химических веществ. Более предпочтительно стрессом является соль, заморозки или засуха. Наиболее предпочтительно стресс представляет наличие концентрации соли более чем 100 мМ или температуру ниже 0°С.

Молекула  нуклеиновой кислоты может представлять собой кДНК, РНК или их гибридную  молекулу. Предпочтительно молекулой  нуклеиновой кислоты является молекула кДНК, кодирующая орнитинаминотрансферазу (ОАТ). Наиболее предпочтительно молекула кДНК имеет нуклеотидную последовательность, которая по существу представляет таковую, представленную на фиг.2 (SEQ ID NO: 1), или ее биологически активный фрагмент.

Молекулу  нуклеиновой кислоты можно интегрировать  в геном клетки-хозяина, или она  может находиться в виде внехромосомного  элемента.

Молекулу  нуклеиновой кислоты орнитинаминотрансферазы (ОАТ) можно выделить из любого вида растений. Предпочтительно растение представляет собой Arabidopsis thaliana.

Растение  пшеницы, трансформированное молекулой  нуклеиновой кислоты орнитинаминотрансферазы (ОАТ), может представлять любой сорт растения пшеницы. Предпочтительно  растение пшеницы выбрано из группы, состоящей из Triticum aestivum и Triticum durum.

В третьем  аспекте настоящее изобретение  также относится к трансгенному растению пшеницы, растительному материалу, семенам или потомству, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, которая  кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ), где экспрессия данной молекулы нуклеиновой  кислоты приводит к получению  трансгенного растения, растительного  материала, семян или потомства, которые способны расти в присутствии  концентрации соли более чем 100 мМ.

В четвертом  аспекте настоящее изобретение  относится к конструкции нуклеиновой  кислоты, включающей промотор, выделенный из растения, и ген орнитинаминотрансферазы (ОАТ), имеющий определенные здесь  значения.

Промотор  может быть конститутивным, убиквитиновым, индуцируемым стрессом, тканеспецифическим или функционирующим на определенных стадиях развития. Предпочтительно  промотор является промотором убиквитина.

В одном варианте осуществления конструкция по существу представляет таковую, представленную на фиг.1. Однако, очевидно, понятно, что в условиях in vitro можно получить модифицированные и вариантные формы конструкций способами химической и ферментной обработки или в условиях in vivo способами технологии рекомбинантной ДНК. Такие конструкции могут отличаться от раскрытых, например, в результате одной или нескольких нуклеотидных замен, делеций или вставок, но по существу они сохраняют биологическую активность конструкции или молекулы нуклеиновой кислоты по данному изобретению.

В другом варианте осуществления трансгенное растение пшеницы дополнительно включает эндогенную систему деградации пролина, активность которой подавлена.

Трансгенное растение может дополнительно включать полинуклеотид, который кодирует селектируемый  маркер и который функционально  связан с полинуклеотидом, который  кодирует ОАТ, посредством чего облегчается  отбор трансгенного растения пшеницы.

Подробное описание изобретения

В практике настоящего изобретения используются, если не указано иначе, обычные способы  молекулярной биологии, биологии растений и рекомбинантной ДНК, которые находятся  в пределах возможностей специалистов в данной области. Такие способы  являются хорошо известными специалистам в данной области, и они полностью  поясняются в литературе. Например, смотри Maniatis, Fritsch & Sambrook, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (1982); «DNA Cloning: A Practical Approach», Volumes I and II (D.N.Glover, Ed., 1985); «Oligonucleotide Synthesis» (M.J.Gait, Ed., 1984); «Nucleic Acid Hybridization» (B.D.Hames & S.J.Higgins, eds., 1985); «Transcription and Translation» (B.D.Hames & S.J.Higgins, eds., 1984); B.Perbal, «A Practical Guide to Molecular Cloning»(1984) и Sambrook et al., «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» 12^th edition (1989).

Очевидно, понятно, что изобретение не ограничивается описанными конкретными веществами и способами, поскольку они могут  варьироваться. Также понятно, что  использованная здесь терминология предназначается только для цели описания конкретных вариантов осуществления  и не предназначена для ограничения  объема настоящего изобретения, который  будет ограничиваться только прилагаемой  формулой изобретения. Необходимо отметить, что, как использовано здесь и  в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественные формы, если только контекст четко не указывает на иное. Так, например, в отношении «полинуклеотида» он включает множество таких полинуклеотидов, и в отношении «энхансерного  элемента» он относится к одному или нескольким энхансерным элементам. Несмотря на то, что для практики или тестирования настоящего изобретения можно использовать любые вещества и способы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, далее будут описаны предпочтительные вещества и способы.

В одном из наиболее широких аспектов настоящего изобретения предусматривается  применение трансгена, сконструированного для получения трансгенного растения пшеницы, которое экспрессирует  ген орнитинаминотрансферазы (ОАТ). Орнитинаминотрансфераза (ОАТ) представляет собой фермент пути метаболизма  орнитина, при участии которого продуцируется  пролин в растительной клетке. ОАТ  катализирует перенос аминогруппы  с орнитина на альфа-кетоглутарат с  образованием глутамат-5-полуальдегида  и глутаминовой кислоты. Следовательно, в том смысле, в котором он здесь  используется, термин «трансгенное растение»  относится к растению, которое  содержит полинуклеотидную последовательность ОАТ, включая, но не ограничиваясь полинуклеотидами, которые, возможно, в норме отсутствуют, последовательности ДНК, которые в норме не транскрибируются в РНК или транслируются в белок («экспрессируются»).

Таким образом, после идентификации подходящего  растения-хозяина пшеницы, что уже  обсуждалось выше, конструируют трансген, который содержит один или несколько  полинуклеотидов ОАТ или их функционально  активные фрагменты. Термин «функционально активный» при использовании  по отношению к полинуклеотидам  ОАТ по настоящему изобретению относится  к примерной конструкции, в которой  изменение нуклеотидной последовательности необязательно оказывает влияние  на способность последовательности кодировать полипептид, способный осуществлять по существу такую же функцию, как  неизмененный «родительский» полипептид. Например, нуклеотидную последовательность можно усечь, удлинить или подвергнуть  мутации таким образом, чтобы  полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, отличался от «родительской» последовательности, но по-прежнему кодировал полипептид, который способен функционировать  по существу таким же образом, как и «родительская» молекула. Следовательно, функционально активное производное, аналог, гомолог или вариант полинуклеотида ОАТ по настоящему изобретению будет иметь нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, представленной на фиг.2 (SEQ ID NO: 1), но полипептид, кодируемый функционально активным производным, аналогом, гомологом или вариантом, способен проявлять одну или несколько известных функциональных активностей, характерных для полипептидов ОАТ. Такие модификации можно осуществить сайт-направленным мутагенезом, или они могут быть спонтанными.

В одном варианте осуществления полинуклеотиды ОАТ  представляют собой молекулы двухцепочечной ДНК, имеющие, по меньшей мере, 85% идентичность по нуклеотидной последовательности с SEQ ID NO: 1. После идентификации и  выделения или конструирования  соответствующего трансгена его  вставляют в экспрессирующий  вектор с помощью стандартных  методов. Следовательно, настоящее  изобретение также включает экспрессирующий  вектор, содержащий трансген по настоящему изобретению. Таким образом, в одном  варианте осуществления конструируют экспрессирующий вектор, который  содержит выделенную и очищенную  молекулу ДНК, включающую промотор, функционально  связанный с кодирующей областью для ОАТ, где кодирующая область  функционально связана с областью терминации транскрипции, посредством  чего промотор регулирует транскрипцию кодирующей области. Кодирующая область  может включать сегмент или последовательность, кодирующую ген ОАТ. Молекула ДНК, содержащая экспрессирующий вектор, также может  включать интрон растительного происхождения  и может также содержать другие элементы растительного происхождения, такие как последовательности, кодирующие нетранслируемые последовательности (UTL), и последовательности, которые  функционируют в качестве энхансеров транскрипции или трансляции.

Предпочтительные  векторы для трансформации растений включают, но не ограничиваются этим, таковые, полученные из плазмиды Ti Agrobacterium tumefaciens, а также раскрытые, например, Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) и в заявке на европейский патент 0120516 (каждый из этих источников включен здесь для  сведения).

Поскольку для  трансформации растения пшеницы  предпочтительно используют экспрессирующие  векторы по настоящему изобретению, то выбирают промотор, который обладает способностью регулировать экспрессию в данном конкретном виде растений. В данной области также хорошо известны промоторы, которые функционируют  в различных видах растений. Промоторы, которые пригодны для экспрессии полипептида в растениях, представляют таковые, которые являются индуцируемыми, вирусными, синтетическими или конститутивными, как уже были описаны (Odell et al., 1985, выше), и/или временно регулируемыми, пространственно регулируемыми  и пространственно-временно регулируемыми. Предпочтительные промоторы включают сильные промоторы CaMV35S и промотор FMV35S.

Экспрессия  гена, который находится в двухцепочечной ДНК, локализованной в ядерном геноме растения, включает транскрипцию матричной РНК (мРНК) из кодирующей цепи ДНК под действием фермента РНК-полимеразы и последующий процессинг первичного транскрипта мРНК внутри ядра. Область ДНК, называемая «промотором», регулирует транскрипцию ДНК в мРНК. ДНК, содержащая промотор, представляет последовательность оснований, которая дает сигналы для РНК-полимеразы для связывания с ДНК и инициации транскрипции мРНК с использованием одной из цепей ДНК в качестве матрицы для образования соответствующей цепи РНК. Выбранный конкретный промотор должен быть способен обеспечивать достаточную транскрипцию кодирующей последовательности ОАТ с воспроизведением существенной защиты от стресса окружающей среды в полученном растении.

Полинуклеотиды  ОАТ по настоящему изобретению могут  регулироваться под действием разнообразных  промоторов в растительных тканях. Промоторы могут быть почти конститутивными (т.е. они регулируют транскрипцию трансгена  во всех тканях), такие как промотор CaMV35S, 1'- или 2'-промотор, полученный из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, или тканеспецифический или специфический для определенных стадий развития промотор. Сильные  или двойные варианты промоторов CaMV35S и FMV35S являются особенно пригодными в практике настоящего изобретения (Kay et al., 1987; Rogers, патент США  5378619).

Альтернативно промотор растения может находиться под контролем окружающей среды. Такие промоторы называются здесь  «индуцируемыми» промоторами. Примеры  условий окружающей среды, которые  могут оказывать влияние на транскрипцию под действием индуцируемых промоторов, включают воздействие патогена, анаэробные условия или наличие света.

Предпочтительно использовать промотор, который был  бы способен обеспечить высокую экспрессию. Такие промоторы включают, но не ограничиваются промотором убиквитина кукурузы, описанным Christensen and Quail (1996), промотором актина риса, описанным McElroy D., Blowers A.D., Jenes B. и Wu R. (1990), промотором вируса мозаики  коммелины, описанный Medberry SL, Lockhart BEL. and Olszewskine (1992).

Очевидно, специалисты  в данной области понимают, что  имеется ряд промоторов, которые  активны в растительных клетках, и они описаны в литературе. Такие промоторы можно получить из растений или вирусов растений, и они включают, но не ограничиваются промоторами нопалинсинтазы (NOS) и  октопинсинтазы (OСS) (которые переносят в онкогенных плазмидах A. tumefaciens), 19S- и 35S-промоторами вируса мозаики цветной капусты (CaMV), светоиндуцируемыми промотором из малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфат-карбоксилазы (ssRUBISCO, очень распространенного растительного полипептида), промотором Act1 риса и 35S-промотором вируса мозаики норичника шишковатого (FMV). Все данные промоторы использовали для создания различных типов ДНК-конструкций, которые экспрессировались в растениях (например, смотри McElroy et al., 1990, патент США 5463175).

Кроме того, также может быть предпочтительным обеспечить экспрессию полинуклеотида ОАТ при использовании интегрирующих  в растения векторов, содержащих тканеспецифический промотор. Конкретные ткани-мишени могут  включать лист, стебель, корень, клубень, семя, фрукт и т.д., и выбранный  промотор должен обладать желаемой тканеспецифичностью  и специфичностью для отдельных  стадий развития. Следовательно, функция  промотора должна быть оптимизирована выбором промотора со способностью к экспрессии в желаемой ткани  и соответствующей силой промотора  и выбором трансформанта, в котором  создается желаемый уровень устойчивости к стрессу в тканях-мишенях. Обычно применяется данный подход отбора из пула трансформантов по экспрессии гетерологичных структурных генов в растениях, поскольку имеется различие между  трансформантами, включающими один и тот же гетерологичный ген, за счет сайта вставки гена в геном  растения (обычно называемый «эффектом  положения»). В дополнение к промоторам, о которых известно, что они  вызывают транскрипцию (конститутивную или тканеспецифическую) ДНК в  растительных клетках, можно идентифицировать другие промоторы для применения в настоящем изобретении скринингом библиотеки кДНК растений для генов, которые избирательно или предпочтительно  экспрессируются в тканях-мишенях, затем определением промоторных  областей.

Другими примерами  тканеспецифических промоторов являются промоторы сахарозосинтетазы 1 (Yang et al., 1990), алкогольдегидрогеназы кукурузы (Vogel et al., 1989), светлого урожайного комплекса  кукурузы (Simpson, 1986), белка теплового  шока кукурузы (Odell et al., 1985, выше), малой  субъединицы карбоксилазы RuBP гороха (Poulsen et al., 1986; Cushmore et al., 1983), маннопинсинтазы Ti-плазмиды (McBride and Summerfelt, 1989), нопалинсинтазы Ti-плазмиды (Langridge et al., 1989), калконизомеразы петуньи (Van Tunen et al., 1988), богатого глицином белка 1 бобов (Keller et al., 1989), транскрипта CaMV35S (Odell et al., 1985, выше) и пататина картофеля (Wenzler et al., 1989). Предпочтительными промоторами являются промоторы вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S) и малой субъединицы S-E9 карбоксилазы RuBP.

Промоторы, использованные в конструкциях ДНК по настоящему изобретению, если желательно, можно  модифицировать для воздействия  на их регуляторные характеристики. Например, промотор CaMV35S можно лигировать с  участком гена ssRUBISCO, который репрессирует экспрессию ssRUBISCO при отсутствии света, в целях создания промотора, который  активен в листьях, но не активен  в корнях. Для целей данного  описания фраза промотор «CaMV35S» включает вариации промотора CaMV35S, например, промоторы, полученные лигированием с областями  оператора, неспецифическим или  регулируемым мутагенезом и т.д. Кроме того, промоторы можно изменить таким образом, чтобы они включали множественные «энхансерные последовательности»  для способствования высокой  экспрессии гена. Kay et al., (1987) сообщили о  примерах таких энхансерных последовательностей.

Трансгенное растение по настоящему изобретению, полученное из трансформированной растительной клетки с тканеспецифическим промотором, можно  подвергнуть скрещиванию со вторым трансгенным растением, полученным из трансформированной растительной клетки с другим тканеспецифическим промотором, с получением гибридного трансгенного растения, которое проявляет эффекты  трансформации в более чем  одной определенной ткани.

РНК, полученная из ДНК-конструкции по настоящему изобретению, может также содержать 5'-концевую нетранслируемую лидерную последовательность (5'UTL). Данную последовательность можно получить из промотора, выбранного для экспрессии гена, и можно специфически модифицировать таким образом, чтобы усилить трансляцию мРНК. 5'-концевые нетранслируемые области можно также получить из вирусных РНК, из подходящих эукариотических генов или из последовательности синтетического гена. Настоящее изобретение не ограничивается конструкциями, в которых нетранслируемая область происходит из 5'-концевой нетранслируемой последовательности, которая сопровождает промоторную последовательность. Одной лидерной последовательностью растительного гена для применения в настоящем изобретении является лидер белка теплового шока 70 (hsp70) петуньи (Winter et al., 1988).

5'-концевые UTL способны регулировать экспрессию  гена, когда они находятся в  последовательности ДНК между  сайтом инициации транскрипции  и стартом кодирующей последовательности. Собраны данные по лидерным  последовательностям для прогноза  оптимальных и субоптимальных  последовательностей и получения  «консенсусных» и предпочтительных  лидерных последовательностей (Joshi, 1987). Предусматривается, что предпочтительные  лидерные последовательности включают  таковые, содержащие последовательности  с прогнозом наличия прямой  оптимальной экспрессии связанного  структурного гена, т.е. включают  предпочтительную консенсусную  лидерную последовательность, которая  может повысить или поддержать  стабильность мРНК и предупредить  несоответствующую инициацию трансляции. Выбор таких последовательностей  будет понятен специалистам в  данной области в свете настоящего  раскрытия. Наиболее предпочтительными  являются последовательности, полученные  из генов с высокой экспрессией  в растениях и, в частности,  в кукурузе. Одним особенно пригодным  лидером может быть лидер HSP70 петуньи.

Для оптимизированной экспрессии в экспрессирующую ДНК-конструкцию  можно также вставить интрон. Как  правило, такой интрон помещают около 5'-конца мРНК в нетранслируемой  последовательности. Данный интрон можно  получить, но не ограничиваясь этим, из ряда интронов, состоящего из интрона белка теплового шока кукурузы (HSP) 70 (патент США 5424412, 1995), интрона Act1 риса (McElroy et al., 1990), интрона 1 Adh (Callis et al., 1987) или интрона сахарозосинтазы (Vasil et al., 1989).

3'-концевая  нетранслируемая область генов  по настоящему изобретению, которая  находится в ядерном геноме  растения, также содержит сигнал  полиаденилирования, который функционирует  в растениях для добавления  аденилатнуклеотидов к 3'-концу  мРНК. РНК-полимераза транскрибирует  кодирующую последовательность  ДНК ядерного генома через  сайт, в котором имеет место  полиаденилирование. Как правило,  последовательности ДНК, расположенные  на расстоянии несколько сотен  оснований справа от сайта  полиаденилирования, служат для  терминации транскрипции. Данные  последовательности ДНК называются  здесь областями терминации транскрипции. Данные области необходимы для  эффективного полиаденилирования транскрибированной матричной РНК (мРНК). Примерами предпочтительных 3'-концевых областей являются 1) 3'-концевые транскрибируемые, нетранслируемые области, содержащие сигнал подиаденилирования генов онкогенной (Ti) плазмиды Agrobacterium, таких как ген нопалинсинтазы (NOS) и 2) 3'-концы генов растений, таких как ген малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы гороха, обозначенной здесь как Е9 (Fischhoff et al., 1987). Как правило, конструкции будут включать полинуклеотиды ОАТ наряду с 3'-концевой последовательностью ДНК, которая функционирует в качестве сигнала для терминации транскрипции и в конструкциях, предназначенных для экспрессии ядерного генома, для полиаденилирования полученной мРНК. Наиболее предпочтительными 3'-концевыми элементами рассматриваются таковые, происходящие из гена нопалинсинтазы A. tumefaciens (nos 3'-конец) (Bevan et al., 1983), терминатор транскрипта Т7 из гена октопинсинтазы A. tumefaciens и 3'-конец генов ингибитора I или II протеазы из картофеля или томата. Когда желательно, можно дополнительно включить регуляторные элементы, такие как элемент OMEGA TMV (Gallie et al., 1989).

Для повышения  экспрессии можно использовать энхансеры  транскрипции или дупликаторы энхансеров. Часто данные энхансеры обнаруживают в 5'-конце от старта транскрипции в  промоторе, который функционирует  в эукариотических клетках, но часто  его можно вставить в прямом и  обратном направлении от 5' к 3' по отношению  к кодирующей последовательности. Примеры  энхансеров включают элементы из промотора CaMV35S, генов октопинсинтазы (Ellis et al., 1987), гена актина риса и промотора  из эукариотов, не относящихся к  растениям (например, дрожжей; Ma et al., 1988).

В некоторых  вариантах осуществления изобретения  применяют элементы внутренних сайтов связывания рибосомы (IRES) для создания мультигена, или полицистронных мРНК. Элементы IRES способны обходить модель сканирования рибосомы 5'-метилированнной  кэп-зависимой трансляции и начинать трансляцию на внутренних сайтах (Pelletier and Sonenberg, 1985). Описаны элементы IRES двух членов семейства пикорнавирусов (вируса полиомиелита и энцефаломиокардита) (Pelletier and Sonenberg, 1988), а также IRES из мРНК млекопитающих (Macejak and Sarnow, 1991). Элементы IRES можно связать с гетерологичными  открытыми рамками считывания. Много  открытых рамок считывания можно  транскрибировать вместе; каждая разделенная IRES, приводя к образованию полицистронных мРНК. С помощью элемента IRES каждая открытая рамка считывания является доступной для рибосом для  эффективной трансляции. Можно эффективно экспрессировать много генов  с использованием одного промотора/энхансера  для транскрибирования одной  мРНК.

Любую гетерологичную открытую рамку считывания можно  связать с элементами IRES. Это включает гены секретируемых белков, мультисубъединичных  белков, кодируемые независимыми генами, гены внеклеточных или связанных  с мембраной белков и селектируемых  маркеров. Таким образом, можно обеспечить одновременную экспрессию нескольких белков в клетке с использованием одной конструкции и одного селектируемого маркера.

Выбор такого экспрессирующего вектора и, в конечном итоге, с каким промотором будет функционально связан полинуклеотид ОАТ непосредственно зависит от клетки-хозяина, предназначенной для трансформации. Это хорошо известные ограничения, имеющиеся в области конструирования молекул рекомбинантной ДНК. Однако вектор, пригодный для практики настоящего изобретения, способен регулировать экспрессию кодирующей ОАТ области, с которой он функционально связан.

Как правило, вектор, включающий последовательность ОАТ, также будет содержать ген-маркер, который придает растительным клеткам  селектируемый фенотип. Например, маркер может кодировать устойчивость к  биоциду, в частности, устойчивость к антибиотику, такую как устойчивость к канамицину, G418, блеомицину, гигромицину, или устойчивость к гербициду, такую  как устойчивость к хлорслуфорону  или фосфинотрицину (активное вещество биалафоса и Баста).

Типичные  векторы, пригодные для экспрессии генов в высших растениях, хорошо известны в данной области, и они  включают векторы, полученные из онкогенной плазмиды (Ti) A. tumefaciens, описанные (Rogers et al., 1987). Однако известно несколько других интегрирующих векторных систем для функционирования в растениях, включая регуляторный вектор переноса рCaMVCN, описанный (Fromm et al., 1985). рCaMVCN (производства Pharmacia, Piscataway, N.J.) содержит промотор CaMV35S.

В одном варианте осуществления вектор, используемый для экспрессии полинуклеотида ОАТ, включает селективный маркер, который  эффективен в растительной клетке. В другом варианте осуществления  гены, кодирующие полинуклеотид ОАТ  и/или селективный маркер, находятся  в двух или более отдельных  векторах. Селективные маркеры могут  представлять собой селективные  маркеры устойчивости к лекарственным  препаратам или метаболические селективные  маркеры. Одним предпочтительным маркером устойчивости к лекарственным препаратам является ген, экспрессия которого приводит к развитию устойчивости к канамицину; т.е. описан химерный ген, включающий промотор нопалинсинтазы, неомицинфосфотрансферазы II Tn5 (nptII) и 3'-концевую нетранслируемую  область нопалинсинтазы (Rogers et al., 1988).

В данной области  хорошо известны способы получения  экспрессирующих векторов. Экспрессирующие (трансформирующие) векторы, используемые для трансформации растений, и  способы получения таких векторов описаны в патентах США 4971908, 4940835, 4769061 и 4757011 (каждый из этих источников включен здесь для сведения). Такие векторы можно модифицировать для включения кодирующей последовательности по настоящему изобретению.

Разнообразные способы были разработаны для  функционального связывания ДНК  с векторами посредством комплементарных  связывающих концов или «затупленных»  концов. Например, комплементарные  гомополимерные хвосты можно добавить к сегменту ДНК, предназначенному для  вставки, и к ДНК-вектору. Затем  вектор и сегмент ДНК соединяют  образованием водородных связей между  комплементарными гомополимерными  хвостами с образованием молекул  рекомбинантной ДНК.

В одном варианте осуществления двухцепочечную ДНК, кодирующую ОАТ, представленную на фиг.2 (SEQ ID NO 1), лигируют с промотором убиквитина и терминатором зеина с образованием экспрессирующего вектора, названного «pGBA2», который представлен на фиг.1.

Предусматривается также растение пшеницы, трансформированное экспрессирующим вектором по настоящему изобретению. Также предусматривается  трансгенное растение, полученное из такой трансформированной или трансгенной  клетки. Очевидно, специалисты в  данной области понимают, что химерный растительный ген растения, включающий структурную кодирующую последовательность по настоящему изобретению, можно вставить в геном растения способами, хорошо известными в данной области. Такие  способы трансформации ДНК растительных клеток включают опосредованную Agrobacterium трансформацию, применение липосом, трансформацию  с использованием вирусов или  пыльцы, электропорацию, трансформацию  протопластов, перенос гена в пыльцу, инъекцию в репродуктивные органы, инъекцию в незрелые зародыши и бомбардировку  частицами. Каждый из данных способов имеет отдельные преимущества и  недостатки. Таким образом, один конкретный способ введения генов в конкретную линию растений необязательно может  быть наиболее эффективным для другой линии растений, но хорошо известны способы, пригодные для каждой линии  растений.

Имеется много  способов введения трансформирующих сегментов  ДНК в клетки, но не все являются подходящими для доставки ДНК  в растительные клетки. Полагают, что подходящие способы практически включают любой способ, с помощью которого ДНК можно вставить в клетку, такой как инфицирование A. tumefaciens и близкими штаммами Agrobacterium, прямая доставка ДНК, такая как, например, опосредованная ПЭГом трансформация протопластов (Omirulleh et al., 1993), с помощью опосредованного высушиванием/подавления захвата ДНК, электропорации, перемешивания с волокнами из карбида кремния, ускорения покрытых ДНК частиц и т.д. В некоторых вариантах осуществления способы ускорения являются предпочтительными, например, бомбардировка микрочастицами и тому подобное.

Специалистам  в данной области хорошо известна технология введения ДНК в клетки. Описано четыре основных способа  доставки гена в клетки: 1) химические методы (Graham and van der Eb, 1973); 2) физические методы, такие как микроинъекция (Capecchi, 1980), электропорация (Wong and Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) и генное «ружье» (Johnston and Tang, 1994; Fynan et al., 1993); 3) вирусные векторы (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis and Anderson, 1988a, 1988b); и 4) опосредуемые рецепторами механизмы (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992).

Обработка различных  животных и растительных клеток короткими  электрическими импульсами высокого напряжения приводит к образованию нанометровых отверстий в плазматической мембране. ДНК непосредственно проходит в  клеточную цитоплазму через данные отверстия или в результате перераспределения  мембранных компонентов, которое происходит при закрытии отверстий. Электропорация может быть очень эффективной, и  ее можно использовать для временной  экспрессии клонированных генов  и для получения клеточных  линий, которые несут интегрированные  копии интересующего гена. В противоположность  опосредованной кальцием фосфатом трансфекции  и слиянию протопластов электропорация часто приводит к образованию  клеточных линий, которые несут  одну или большей частью несколько  интегрированных копий чужеродной ДНК.

Введение  ДНК с помощью элекропорации  является хорошо известным специалистам в данной области. Для проведения трансформации электропорацией  можно использовать рыхлые ткани, такие  как суспензионная культура клеток или зародышевый каллус, или альтернативно  можно непосредственно трансформировать незрелые зародыши или другие организованные ткани. Следует частично разрушить  клеточные стенки выбранных клеток, подвергнув их воздействию разрушающих  пектин ферментов (пектолиаз) или механическому  разрушению в контролируемых условиях, делая клетки более восприимчивыми к трансформации. Затем такие  клетки становятся реципиентами для  переноса ДНК электропорацией, которую  можно провести на данной стадии, и  затем идентифицировать трансформированные клетки подходящим отбором или скринингом в зависимости от природы вновь включенной ДНК.

Дополнительным  преимущественным способом доставки трансформирующих сегментов ДНК в растительные клетки является бомбардировка микрочастицами. В данном способе частицы можно  покрыть нуклеиновыми кислотами  и доставить в клетки с помощью  движущей силы. Примеры частиц включают таковые из вольфрама, золота, платины  и тому подобное. С использованием данных частиц ДНК переносятся через  клеточную стенку и в цитоплазму на поверхности небольших металлических  частиц, как это описано (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; Kawata et al., 1988). Металлические  частицы проникают через несколько  слоев клеток и таким образом  обеспечивают трансформацию клеток внутри эксплантатов ткани.

Преимущество  бомбардировки микрочастицами, в  дополнение к тому, что она является эффективным средством для воспроизводимо стабильной трансформации растительных клеток, заключается в том, что  для нее не требуется ни выделения  протопластов (Cristou et al., 1988), ни наличия  чувствительности к инфицированию Agrobacterium. Показательным вариантом  осуществления способа доставки ДНК в растительные клетки ускорением является биолистическая система для  доставки частиц, которую можно использовать для доставки частиц, покрытых ДНК  или клетками через сито, такое  как сито из нержавеющей стали  или Nytex, на поверхность фильтра, покрытого  культивированными растительными  клетками в суспензии. Сито распределяет частицы таким образом, что они  не доставляются в клетки-реципиенты в виде крупных агрегатов. Полагают, что сито, расположенное между  устройством для частиц и клетками, предназначенными для бомбардировки, приводит к уменьшению размера агрегатов  частиц и может вносить свой вклад  в обеспечение более высокой  частоты трансформации снижением  числа повреждений, возникающих  в клетках-реципиентах под действием  частиц, которые являются слишком  крупными.

Для бомбардировки  клетки в суспензии предпочтительно  концентрируют на фильтрах или на твердой культуральной среде. Альтернативно  незрелые зародыши или другие клетки-мишени можно расположить на твердой  культуральной среде. Клетки, предназначенные  для бомбардировки, располагают  на соответствующем расстоянии ниже тормозной платы для микрочастиц. Если желательно, то одно или более  сит также можно поместить  между ускорительным устройством  и клетками для бомбардировки. При  использовании приведенной ниже методики можно получить до 1000 или  более фокусов клеток, временно экспрессирующих  ген-маркер. Количество клеток в фокусе, которые экспрессируют продукт  экзогенного гена в течение 48 ч  после бомбардировки, часто может  находиться в пределах от 1 до 10 и  в среднем составлять 1-3.

При трансформации  бомбардировкой можно оптимизировать условия культивирования перед  бомбардировкой и параметры бомбардировки  для получения максимального  числа стабильных трансформантов. В  данной технологии важными являются физические и химические параметры  бомбардировки. Физическими факторами  являются таковые, которые включают манипулирование с преципитатом ДНК/микрочастиц, или таковые, которые  оказывают влияние на полет и  скорость макро- и микрочастиц. Биологические факторы включают все стадии манипуляций с клетками перед и сразу же после бомбардировки, корректировку осмоса клеток-мишеней для избежания повреждения, связанного с бомбардировкой, и также природу трансформирующей ДНК, такую как линеаризованная ДНК или интактные суперспиральные плазмиды. Полагают, что манипуляции перед бомбардировкой имеют особое значение для успешной трансформации незрелых растительных зародышей.

Следовательно, предусматривается, что может быть желательным предварительно скорректировать  несколько параметров бомбардировки  в маломасштабных исследованиях  для полной оптимизации условий. В частности, может быть желательным  подвергнуть корректировке физические параметры, такие как длина щели, длина полета, длина ткани и  давление гелия. Также можно свести до минимума факторы снижения повреждения (TRF) модификацией условий, влияющих на физиологическое состояние клеток-реципиентов, и которые, следовательно, могут  оказать влияние на эффективность  трансформации и интеграции. Например, можно подвергнуть корректировке  осмотическое состояние, гидратацию ткани  и стадию субкультивирования или  клеточный цикл клеток-реципиентов  для оптимальной трансформации. Специалистам в данной области известно осуществление других обычных корректировок  в свете настоящего раскрытия.

Специалистам  в данной области хорошо известны способы опосредованной частицами  трансформации. В патенте США  5015580 (специально включенном здесь для сведения) описывается трансформация соевых бобов с использованием такой методики.

Опосредуемый  Аgrobacterium перенос представляет собой широко применяемую систему для введения генов в растительные клетки, поскольку ДНК можно ввести в ткани целого растения, элиминируя тем самым необходимость в регенерации интактного растения из протопласта. В данной области хорошо известно применение опосредованных Аgrobacterium растительных интегрирующих векторов для введения ДНК в растительные клетки. Например, смотри описанные способы (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). Генная инженерия растений хлопчатника с использованием опосредованного Аgrobacterium переноса описана в патенте США 5004863 (специально включенном здесь для сведения); как и описана в патенте США 5349124 трансформация растений латука (специально включенном здесь для сведения); и опосредованная Аgrobacterium трансформация соевых бобов в патенте США 5416011 (специально включенном здесь для сведения). Кроме того, интеграция Ti-ДНК представляет собой относительно точный способ, приводящий к незначительным перерасположениям. Область ДНК, предназначенную для переноса, определяют по граничащим последовательностям, и, как правило, вставку ДНК в геном растений проводят, как описано (Spielmann et al., 1988; Jorgensen et al., 1987).

Современные векторы для трансформации с  участием Аgrobacterium способны реплицироваться в E. coli, а также Аgrobacterium, что позволяет проводить соответствующие манипуляции, как описано (Klee et al., 1985). Кроме того, недавние технологические достижения в области векторов для опосредованного Аgrobacterium переноса генов привели к усовершенствованию расположения генов и сайтов рестрикции в векторах для облегчения конструирования векторов, способных экспрессировать различные кодирующие полипептиды гены. Векторы, описанные (Rogers et al., 1987), содержат удобные мультилинкерные области, фланкированные промотором и сайтом полиаденилирования, для непосредственной экспрессии вставленных кодирующих полипептид генов и являются подходящими для настоящих целей. Кроме того, для трансформаций можно использовать Аgrobacterium, содержащие «вооруженные» и «разоруженные» Ti-гены. В сортах растений, для которых является эффективной опосредованная Аgrobacterium трансформация, этот способ является способом выбора за счет простоты его постановки и определенной природы переноса гена.

Оказалось, что  опосредованная Аgrobacterium трансформация листовых дисков и других тканей, таких как семядоли и гипокотили, ограничивается растениями, которые инфицируются Аgrobacterium в природе. Опосредованная Аgrobacterium трансформация является наиболее эффективной для двудольных растений. Оказалось, что только некоторые однодольные растения являются естественными хозяевами для Аgrobacterium, хотя описано получение трансгенных растений спаржи с использованием векторов на основе Аgrobacterium (Bytebier et al., 1987). Недавно другие однодольные растения также были трансформированы Аgrobacterium. В эту группу входит кукуруза (Ishida et al., 1996) и рис (Cheng et al., 1998).

Трансгенное растение, полученное с использованием способов трансформации с участием Аgrobacterium, как правило, содержит один ген на одну хромосому. Такие трансгенные растения можно отнести к гетерозиготным в отношении добавленного гена. Однако поскольку использование слова «гетерозиготный», как правило, указывает на присутствие комплементарного гена в том же локусе второй хромосомы из пары хромосом, и такой ген отсутствует в растении, включающем один добавленный ген, как это здесь имеет место, то полагается, что более точным названием такого растения является независимый сегрегант, поскольку добавленный, экзогенный ген независимо расщепляется во время митоза и мейоза.

Независимый сегрегант может быть предпочтительным, когда растение является промышленно доступным в качестве гибрида, такое как кукуруза. В данном случае независимый сегрегант, содержащий ген, подвергают скрещиванию с другим растением с получением растения-гибрида, которое является гетерозиготным в отношении интересующего гена.

Альтернативное  преимущество трансгенного растения заключается  в том, что оно является гомозиготным для добавленного полинуклеотида ОАТ; т.е. трансгенное растение содержит два добавленных гена, один ген  в том же локусе в каждой хромосоме  из пары хромосом. Гомозиготное трансгенное  растение можно получить половым  скрещиванием (самоопылением) независимого сегрегантного трансгенного растения, которое содержит один добавленный  ген, развитием некоторых из полученных семян и анализом полученных растений, продуцированных на активность интересующего  гена и менделевского наследования, указывая на гомозиготность по сравнению  с контрольным (природным, нетрансгенным) или независимым сегрегантным трансгенным  растением.

Два различных  трансгенных растения можно подвергнуть  скрещиванию с получением потомства, которое содержит два независимо расходящихся, добавленных экзогенных гена. Самоопыление соответствующего потомства может дать растения, которые  являются гомозиготными для обоих  добавленных экзогенных генов, которые кодируют интересующий полипептид. Также предусматривается возвратное скрещивание с родительским растением и трансскрещивание с нетрансгенным растением.

Трансформацию растительных протопластов можно проводить  с использованием способов на основе осаждения кальцием фосфатом, обработки  полиэтиленгликолем, электропорации и  комбинаций данных методов (например, смотри Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1985; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988).

Применение  данных систем для зародышей различных  растений зависит от их способности  регенерировать такой конкретный сорт растения из протопластов. Описаны показательные методы регенерации злаковых из протопластов (например, смотри Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1987; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

Для трансформации  зародышей растений, которые невозможно успешно регенерировать из протопластов, можно использовать другие пути для  введения ДНК в интактные клетки и ткани. Например, можно проводить  регенерацию злаковых из незрелых зародышей  или эксплантатов, как это описано (Vasil, 1988).

Также ДНК  можно вводить в растения прямым переносом ДНК в пыльцу, как  это описано (Zhou et al., 1983; Hess, 1987). Экспрессию генов, кодирующих полипептид, можно  обеспечить инъекцией ДНК в репродуктивные органы растения, как это описано (De La Pena et al., 1987). ДНК можно также  инъецировать непосредственно в  клетки незрелых зародышей и ввести в клетки регидратацией высушенных зародышей, как это описано (Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986).

После проведения доставки экзогенных полинуклеотидов  ОАТ в клетки-реципиенты пшеницы  следующая стадия получения трансгенных  растений пшеницы по настоящему изобретению, как правило, заключается в идентификации  трансформированных клеток для дальнейшего  культивирования и регенерации  растения. Как уже упоминалось  выше, для повышения возможности  идентифицировать трансформанты может  быть желательным использовать селектируемый  или выявляемый в скрининге ген-маркер или в дополнении к этому полинуклеотид  ОАТ. В данном случае затем, как правило, следует анализировать популяцию  потенциально трансформированных клеток, подвергнув клетки воздействию селективного реагента или реагентов, или провести скрининг на наличие признака желаемого  гена-маркера.

Примерный вариант  осуществления способов идентификации  трансформированных клеток включает воздействие  на трансформированные культуры селективным  реагентом, таким как ингибитор  метаболизма, антибиотик, гербицид и  тому подобное. Клетки, которые были трансформированы и содержат стабильно  интегрированный вставленный ген-маркер, придающий устойчивость к использованному  селективному реагенту, будут расти и делиться в культуре. Чувствительные клетки будут не способны к дальнейшему культивированию. Один пример предпочтительного гена-маркера придает устойчивость к глифосату. Когда в качестве селективного маркера используется данный ген, то культуру предполагаемо трансформированных клеток обрабатывают глифосатом. При обработке трансгенные клетки будут доступны для последующего культивирования, в то время как чувствительные или нетрансформированные клетки - нет. Данный способ подробно описан в патенте США 5569834, который специально включен здесь для сведения. Другим примером предпочтительной системы селективного маркера является система резистентности неомицинфосфотрансферазы (nptII), с помощью которой придается резистентность к антибиотику канамицину, как это описано в патенте США 5569834 (который специально включен здесь для сведения). Вновь после трансформации данной системой трансформированные клетки будут подвергаться дальнейшему культивированию при обработке канамицином, в то время как нетрансформированные клетки - нет. Еще одна предпочтительная селективная маркерная система включает применение генной конструкции, придающей устойчивость к паромомицину. Применение данного типа селективной маркерной системы описано в патенте США 5424412 (который специально включен здесь для сведения).

Другая предпочтительная селективная маркерная система  включает применение генов, предусмотренных  данным изобретением. В частности, у  клеток, трансформированных полинуклеотидом  ОАТ или его функциональными  эквивалентными вариантами, будет развиваться  толерантность к соли. Таким образом, растительные клетки, которые содержат молекулу рекомбинантной ДНК, вставленную в их геном, можно отобрать из популяции клеток, в которые не удалось вставить рекомбинантную молекулу, при культивировании клеток и выделении клеток, которые являются устойчивыми к высоким концентрациям соли.

Дополнительно предусматривается, что для идентификации  трансформированных клеток будут пригодными комбинации выявляемых в скрининге  и селектируемых маркеров. В некоторых  типах клеток или тканей селективный  реагент, такой как глифосат или  канамицин, может не обеспечить в  достаточной мере гибели клеток для  четкого распознавания трансформированных клеток или может вызвать одинаковое существенное неселективное подавление трансформантов и нетрансформантов, приводя к отсутствию эффективности  метода отбора. Предполагается, что  селекция с использованием подавляющего рост соединения, такого как глифосат, в концентрациях ниже вызывающих 100% подавление с последующим скринингом культивируемой ткани на экспрессию выявляемого в скрининге гена-маркера, такого как ген, кодирующий резистентность к канамицину, позволит выделять трансформанты  от типов клеток или тканей, которые  не подвергаются одному отбору. Было предположено, что комбинации отбора и скрининга  могут способствовать идентификации  трансформантов в более широком  ряду типов клеток и тканей.

В данной области  хорошо известно развитие или регенерация  растений из единичных протопластов растений или различных эксплантатов (Weissbach and Weissbach, 1988). Как правило, данный способ регенерации и роста включает стадии отбора трансформированных клеток, культивирование данных отдельных  клеток через обычные стадии эмбрионального развития от стадии приростка с корешком. Трансгенные зародыши и семена регенерируют аналогичным образом. Затем полученные трансгенные корневые побеги высаживают в соответствующую среду для  роста растений, такую как почва.

В дальнейшем изобретение будет дополнительно  описано при обращении только к следующим, не ограничивающим примерам. Однако следует понимать, что последующие  примеры являются только иллюстративными  и никоим образом не ограничивают общую применимость изобретения, описанного выше. В частности, несмотря на то, что  изобретение описано подробно в  отношении применения конкретного  гена ОАТ в двух сортах пшеницы, очевидно, понятно, что установленные здесь  факты не ограничиваются данным источником генов ОАТ или данными сортами  пшеницы.

Список  источников литературы

 
Формула изобретения

1. Толерантное  к стрессу растение пшеницы,  где указанное растение пшеницы  трансформировано молекулой нуклеиновой  кислоты, которая кодирует орнитинаминотрансферазу  (ОАТ).

2. Толерантное  к стрессу растение пшеницы  по п.1, где молекула нуклеиновой  кислоты представляет собой молекулу кДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, которая, по существу, представляет таковую, представленную в SEQ ID N0:1 или ее биологически активный фрагмент.

3. Способ  защиты растения пшеницы от  стресса, включающий стадию введения  молекулы нуклеиновой кислоты  в растение пшеницы, где молекула  нуклеиновой кислоты кодирует  орнитинаминотрансферазу (ОАТ).

4. Способ  по п.3, в котором стресс представляет  соль или засуху.

5. Способ  по п.3, в котором стресс представляет  присутствие более чем 100 мМ  соли.

6. Способ  по любому из пп.3-5, в котором  молекула нуклеиновой кислоты  орнитинаминотрансферазы (ОАТ) выделена  из Arabidopsis thaliana.

7. Способ  по любому из пп.3-6, в котором  растение пшеницы выбрано из  группы, состоящей из Triticum aestivum и  Tciticum durum.

8. Трансгенное  растение пшеницы, растительный  материал или его семена, содержащие  молекулу нуклеиновой кислоты,  которая кодирует орнитинаминотрансферазу  (ОАТ), где экспрессия указанной  молекулы нуклеиновой кислоты  дает трансгенное растение, растительный  материал или его семена, которые  способны расти в присутствии  более чем 100 мМ соли.

9. Конструкция  нуклеиновой кислоты, включающая  промотор, выделенный из растения  и ген орнитинаминотрансферазы  (ОАТ), где указанная конструкция  способна трансформировать растение  пшеницы таким образом, что  указанное растение пшеницы становится  толерантным к стрессу.

10. Конструкция  нуклеиновой кислоты по п.9, где  указанный промотор представляет  конститутивный промотор, промотор  убиквитина, индуцируемый стрессом  промотор, тканеспецифический промотор  или функционирующий на определенных  стадиях развития промотор.

11. Конструкция  нуклеиновой кислоты по п.9, где  указанный промотор представляет  промотор убиквитина.

12. Конструкция  нуклеиновой кислоты по п.9, где  молекула нуклеиновой кислоты  представляет собой молекулу  кДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, которая, по существу, представляет  таковую, представленную в SEQ ID NO:1 или ее биологически активный  фрагмент.

13. Способ  получения трансгенного растения  пшеницы с индуцируемой или  повышенной толерантностью к  соли, где способ включает стадии: 
 
a) трансформации растительной ткани или клетки растения пшеницы молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует орнитинаминотрансферазу (ОАТ); 
 
b) регенерации ткани или клетки в целое растение, и 
 
c) экспрессии ОАТ в регенерированном растении в течение времени и в условиях, достаточных для индукции или повышения толерантности растения к концентрации соли более чем 100 мМ.