Программа и методика исследований

2 ПРОГРАММА  И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

 

Объектом исследований является нервная ткань животных разных таксономических групп.

Программа исследований включала в себя следующие задачи:

1) анализ и обработку  литературных данных по теме  исследования,

2) составление обзора литературных данных,

3) приготавление препарата нервной ткани.

Исследования фиксированного материала проводились на мертвых  тканях и клетках, однако, при оптимальной  фиксации они сохранили морфологические  особенности, свойственные живым объектам. Благодаря этому на основании анализа фиксированного материала можно делать заключения о прижизненном строении клеток и тканей. Типичным артефактом – признак, возникающий в структуре клеток и тканей в результате вмешательства исследователя на различных этапах обработки материала и отсутствующий в них прижизненно − служит сжатие клеток и тканей.

Основные этапы приготовления  гистологического препарата:

1. взятие материала,
2. фиксация,
3. промывка в воде,
4. обезвоживание, уплотнение и заливка,
5. приготовление срезов,
6. окрашивание, просветление.

1. Взятие материала  или биопсия.

Для гистологического исследования берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 см. Материал желательно получать в первые часы после смерти людей и животных. В некоторых случаях материал для гистологического исследования берется у людей прижизненно с помощью специальных инструментов или во время операций. Этот способ получения материала носит название биопсии.

2. Фиксация.

Взятый для гистологического исследования материал подвергается быстрой  фиксации. Фиксация – метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания белков. Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала. Существуют фиксаторы простые и сложные . К простым относятся 10-20% раствор формалина, 96% спирт, 100 (абсолютный) спирт, 1-2% раствор осмиевой кислоты и др. Сложные фиксаторы: спирт – формол (спирт 70% - 100 мл. и формалин 2-5 мл.) жидкость Ценкера (сулема – 5 г, сернокислый натрий - 1 г., двухромовокиолый калий – 2,5 г, дистиллированная вода – 100 мл., ледяная уксусная кислота 5 мл.) и др. Продолжительность фиксации – от нескольких часов до 1 суток и более в зависимости от свойств фиксатора и характера исследуемого материала.

3. Промывка в воде.

После фиксации материал промывают (чаще всего в течение  нескольких часов в дистиллированной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей.

Изучить с помощью микроскопа такие  фиксированные кусочки органов  невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы  кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки – срезы, толщина которых измеряется в микронах. Такие срезы получают с помощью специальных приборов – микротомов. Но для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем пропитывания застывающими жидкостями – жидким парафином или раствором целлоидина в смеси равных частей абсолютного спирта и эфира. Уплотнения можно добиться замораживанием. Ни целлоидин, ни парафин в воде не растворяются, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить, а затем пропитывать целлоидином или парафином.

4. Обезвоживание , уплотнение и заливка.

Обезвоживание и уплотнение ткани  производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания).При заливке  кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для целлоидина (смесь 100 спирта с эфиром поровну) и парафина (ксилол или толуол).

Заливка в парафин. При  заливке в парафин кусочки  из абсолютного спирта переносятся  в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37 до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54% -56%в трех порциях парафина. Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки.

 

Таблица 1 Этапы обезвоживания  и заливки.

 

Этапы	Вещества	Время
1.	Спирт + формалин (10мл формалина 40% + 400 мл спирта 96%)	30 мин
2.	Спирт 60%	30 мин
3.	Спирт 70% − спирт 80% −  спирт 90%	по 30 мин
4.	Спирт 96% − спирт 96% − спирт 96%	по 60 мин
5.	Спирт + хлороформ (50/50)	60 мин
6.	Хлороформ	30 мин
7.	Хлороформ	15 мин
8.	Парафин + хлороформ (50/50), термостат 37-38˚	12 ч
9.	Чистый парафин, термостат 56˚	1ч
10.	Чистый парафин, термостат 56˚	1ч

 

5. Приготовление срезов.

Срезы с блоков изготовляются  на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома  зажимаются целлоидиновый или парафиновый  блок, а также микротомная бритва. Существует механизм, поднимающий объектодержатель на заданное количество микронов. Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 7-10 микронов с целлоидиновых блоков и 3-5 микронов с парафиновых блоков.

6. Окрашивание.

Изготовленные на микротоме срезы окрашиваются. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).

Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо  выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.

Выявление на срезе гистологических  структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры  среза вступают в реакцию с  кислыми красителями и ими  окрашиваются (оксифильные структуры), другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно ими (базофильные структуры). Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями.

По происхождению различают  краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении.

К краскам животного  происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. Большинство красок готовят синтетически (искусственные краски).

По окрашиванию определенных гистологических структур различают  краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры. Ядерные краски – гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин. Цитоплазматические краски – эозин, пикрофуксин.

 

Методика окрашивания  срезов метиленовым синим и их просветление.

Окрашивают срезы после  удаления из них парафина (ксилолом), проводки их через спирты понижающейся концентрации и промывания в воде. Способы окрашивания препаратов многообразны. Из основных красителей чаще используют гематоксилин, кармин, сафранин, метиловый синий, галлоцианин; из кислых — эозин, эритрозин, кислый фуксин, индигокармин и др. Для приготовления препаратов нервной ткани применяют суправитальную окраску метиленовым синим и различные методы импрегнации — восстановление нервными структурами металлов, После окраски хорошо промытые препараты обезвоживают в спиртах восходящей крепости (до 100%), просветляют в смеси карболовой к-ты и ксилола (1:3), выдерживают в 2 порциях ксилола и затем заключают в среду, обеспечивающую сохранность структур объекта, его окраску и прозрачность.