Матричный синтез

     Мысль об удвоении ДНК высказана после построения модели в 1953 году, а в 1956году А. Корнбергом был изучен фермент ДНК-полимераза, без учета которого рассматривать процесс репликации невозможно. Кроме того, необходимо установить виды ДНК-полимеразы, которые по-разному участвуют в сложном процессе удвоения молекулы ДНК.

     В 1957 году Дельбрук и Стент предложили три модели удвоения ДНК: консервативную, полуконсервативную и дисперсную.

     1)Консервативная. Двухцепочечная ДНК сохраняется, но каждая цепь ее строит вторую, дочернюю по правилу комплементарности азотистых оснований.

     2)Полуконсервативная. Представлена в виде расплетающейся биспирали. При этом водородные связи разрываются, а затем формируются дочерние нити ДНК, которые точно копируют родительские. В данном случае дочерняя ДНК обновляется только наполовину, что отличает эту модель от предыдущей.

     М. Мезельсон и Ф. Сталь в 1957 году провели доказательство правильности полуконсервативной модели. Для этого  в течение ряда поколений они  выращивали бактерию – кишечную палочку на питательной среде, содержащей атомы тяжелого изотопа азота ¹⁵ N , и таким образом метили всю родительскую ДНК. Затем клетки переносили на чистую среду с обычным азотом и в процессе культивирования после каждого деления эту среду центрифугировали. Разные точки седиментации давали право судить о плотности фракции ДНК. Оказалось, что уже после первого деления в дочерних молекулах одна из цепочек ДНК содержала меченый азот, а другая – обычный. Это подтверждало полуконсервативную модель удвоения ДНК.

     3)Дисперсная модель. Предложена учеными как один из возможных вариантов удвоения, но она не была подтверждена наукой. Такая модель предусматривает распадение ДНК на фрагменты, а поэтому новая ДНК должна состоять из родительских и дочерних фрагментов.

     Японский биохимик Р. Оказаки исследовал механизм репликации ДНК по полуконсервативному типу. При этом он  заметил, что большинство вновь синтезированных цепей представляют собой короткие фрагменты, которые позднее были названы фрагментами Оказаки. В процессе репликации эти фрагменты сшиваются лигазами за счет фосфодиэфирных связей с 3^/ –OH  группой самого последнего нуклеотида. Фрагменты Оказаки имеют длину 700-800 нуклеотидов.

     В 1966 году Дудней обнаружил на 5^/ –конце фрагмента Оказаки небольшой участок РНК, комплементарно связанный с ДНК. На основании этого Дудней заключил, что для репликации ДНК нужна РНК-овая затравка, что было подтверждено шесть лет спустя Чаргаффом. Следовательно, затравка поставляет свободный 3^/-ОН –конец для матричного синтеза.

     Механизм репликации (синтез ДНК) начинается с присоединения к точке начала репликации фермента хеликазы. Этот фермент расплетает двойную нить ДНК. К каждой из цепей присоединяется ДНК- связующий белок (ДСБ), который препятствует обратному воссоединению цепей. У прокариот имеется фермент ДНК-гираза, который помогает хеликазе раскручивать ДНК. Взаимодействие ферментов с точкой начала репликации называется инициацией репликации. Эта точка движется вдоль цепи ДНК. Фронт репликации представляет собой вилку. Синтез ДНК идет на обеих цепях, как ведущей, так и отстающей. В ведущей цепи тоже имеется РНК - затравка, которая способствует началу синтеза, а затем уже начинает работать ДНК-полимераза III. Фермент продвигается в направлении 5^/-3^/ и по правилу комплементарности азотистых оснований синтезирует ведущую цепь.

     Отстающая цепь представляет собой фрагменты Оказаки. В самом начале фрагмента располагается праймер (10-60 нуклеотидов). Здесь работает фермент примаза (праймаза). Праймер начинает синтез, тогда как продолжает его ДНК-полимераза-III. Синтез идет одновременно во всех фрагментах Оказаки.

     После окончания сборки фрагментов ДНК-полимераза-I удаляет праймер и заполняет бреши нуклеотидными парами. В этом процессе участвуют лигазы, которые сшивают фрагменты. Сам процесс сшивания является элонгацией матричного синтеза. У эукариот много хромосом, а поэтому работает сразу несколько вилок. Что касается прокариот, то у них ДНК имеет кольцевую форму, а поэтому инициация происходит сначала в одной точке, а затем в двух направлениях движется две вилки, которые, описав круг, встречаются. Аналогичным образом идет репликация в молекулах ДНК митохондрий и пластид.

     У вирусов репликация идет в одном  направлении по методу «катящегося  кольца». Точка роста скользит вокруг кольцевой матричной цепи, однако сначала расплетается одна из двух цепей ДНК, затем к 3^/ – концу присоединяется несколько новых нуклеотидов, а 5^/-конец вытесняется. Такой же механизм репликации лежит в основе синтеза генов р-РНК у эукариот в ооцитах.

     Репликация  и рост клетки – это тесно связанные явления. Известно, что частота инициации циклов репликации определяется скоростью роста клетки. Клетки бактерии – кишечной палочки имеют различные скорости репликации, а время удвоения ДНК колеблется в пределах от 18 до 180 мин.

     Однако скорость матричного синтеза при постоянной температуре в определенной степени стабильна. Основным правилом связи инициации репликации с циклом клеточного деления является следующее: чем больше  скорость цитокинеза, тем больше раундов инициации мы наблюдаем. В этом отношении возникает вполне законный вопрос, как узнает клетка, когда нужно инициировать репликацию? Ученые считают, что между числом точек репликации и клеточной массой существует тесная корреляционная связь. Это означает, что те клетки, которые быстро растут, имеют большее число репликативных вилок. Некоторые исследователи полагают, что в течение клеточного цикла наблюдается синтез белка-инициатора, критическое накопление которого является определенным сигналом для инициации матричного синтеза. По другой версии, в определенный момент цикла деления клеток увеличивается в объеме в результате цитокинеза, в результате чего ингибитор как бы разбавляется.

     В обеих версиях бесспорно то, что инициация действительно регулируется клеточной массой, однако не совсем понятна приоритетность белка-инициатора, или белка-ингибитора.

     Поскольку хромосома бактерии замкнута в кольцо и одна вилка движется навстречу  другой, остается загадкой, что происходит при столкновении вилок? Непонятно  также, каким образом освобождаются ферменты, участвовавшие в работе вилки? Оказалось, и это доказано мутациями, что область хромосом, которая является терминатором, не расположена на полпути по кругу хромосомы. Это означает, что вилки пробегают неравные расстояния.

     В заключение следует обратить внимание на механизм начала репликации. Она у бактерии начинается с того, что на ДНК транскрибируется РНК, которая расположена  на расстоянии 555 пар оснований влево от точки начала репликации. Фермент РНКаза отрезает транскрипт в точке начала репликации. Образуется 3^/- конец, который и используется в качестве затравки для синтеза ДНК. Затравка перестает образовываться, когда на пути ее (189 нуклеотидов) по ходу репликации встает белок гена rop. На второй цепи параллельно РНК-затравке синтезируется другой вид РНК. Это РНК I (108 оснований). Обе РНК взаимодействуют и представляют собой вторичную структуру. РНК I предотвращает образование 3^/- конца РНК-затравки, порождаемого при участии фермента РНКазы. В основе этого лежит спаривание оснований РНК I и РНК-затравки.

     Завершая  рассказ о репликации, следует  остановиться еще на одном важном явлении – топологии репликации ДНК. рассмотрение последовательности работы репликационной вилки от точки инициации, расположенной на конце двойной спирали, не вызывает вопросов, поскольку имеется свободный вращающийся конец, однако как обстоит дело в том случае, когда работает сразу несколько вилок. Известно, что цепи разделяются при достаточном количестве энергии и она обеспечивает разрыв нековалентных связей, которые стабилизируют двойную спираль. Цепи взаимозакручены и для разделения их необходимо сильное вращение. Однако одно дело, когда вращаются свободные, уже разделенные концы цепей ДНК, и другое, когда вилки работают в кольцевой структуре и расходятся в разных направлениях. Подобный вопрос логичен и относительно линейной формы, где работает сразу много вилок. Напряжение, которое приводит к суперспирализации, необходимо снимать. Следует учитывать  и то, что большое число вращений тоже нежелательно в векторах живой клетки, да и ДНК ведет себя как структура, утратившая свободные концы. Это и поставило под сомнение правильность объяснений явления репликации в том виде, в каком они представлены в научной и учебной литературе.

     Устранение  положительного суперскручивания возможно, если допустить временный одноцепочечный разрыв: появляется свободный конец, который и вращается вокруг интактной цепи, после чего разрез необходимо ликвидировать. Такие разрывы и лигирование разрывов повторяются многократно. Здесь большую роль играют ферменты топоизомеразы. Эти ферменты влияют на степень суперспирализации. К ним относят и ДНК-гиразу, которая вносит отрицательные сверхвитки. Сюда же относят и топоизомеразу-I , которая устраняет (релаксирует) отрицательные сверхвитки.

     При рассмотрении процесса репликации в отстающей цепи мы постоянно сталкиваемся с работой фрагментов Оказаки, которые моделируют разрывы.

     Б. Льюин делит топоизомеры на два  класса. Ферменты типа I временно надрезают цепь, а ферменты типа II производят разрез.

     У бактерии – кишечной палочки фермент топоизомераза-I связывается с областью разделения двух цепей, разрезает одну из них, а другую протаскивает через образовавшийся пробел. Затем этот пробел залечивает все тот же фермент. Введение разреза в суперскрученную молекулу, позволяет цепи свободно вращаться и устранять, или резко снижать напряжение.

     Гираза  представляет собой топоизомеразу  –II. Она вводит отрицательную суперспирализацию в кольцевую форму ДНК со скоростью около 100 суперспиралей в минуту. Гираза связывается субстратной молекулой ДНК, оборачивает ее вокруг тетрамерного белка. Фермент защищает примерно 140 пар оснований ДНК. Модель изменения знака суперспирализации работает так. Гираза связывается с ДНК в месте перекреста положительной суперспирали, образует компенсирующую отрицательную спираль, затем протаскивает через пробел другую дуплексную цепь и залечивает разрыв. В результате знак спирали изменяется от +1 к -1.

      2.2. Транскрипция 

     Прежде  чем рассматривать сложный механизм транскрипции,  необходимо изучить  понятия «интрон» и «экзон» и само явление сплайсинга (процессинга). По современным представлениям гены имеют самое разнообразное строение и размеры. В этом отношении сегодня нет единой точки зрения на разнообразие генов и их структур. Однако точно известно, что одни гены прерываются, а другие нет. В случае непрерывности генов нуклеотидные последовательности генома строго соответствуют одному из свойств генетического кода (колинеарность), поскольку последовательности нуклеотидов в ДНК соответствуют последовательностям таковых на и-РНК. В большинстве своем гены имеют прерывистое строение и вставки последовательностей сильно различаются по числу и размерам. Но одно неизменно – порядок расположения соответствующих участков в прерывистом гене совпадает с их порядком в зрелой и-РНК.

     Прежде  чем начнется процесс трансляции, следующий за транскрипцией, интроны  необходимо удалить из первичного транскрипта  и в зрелом РНК-продукте, они должны отсутствовать. Процесс удаления интронов, как промежуточных последовательностей из первичного транскрипта, носит название сплайсинга РНК. Для осуществления этого процесса сначала рестриктазы вырезают интронные последовательности, а затем сшивают между собой экзонные последовательности  (экзоны). Из интронно-экзонного первичного транскрипта формируется только экзонный, который потом и участвует в сложном процессе трансляции.

     Таким образом, явление сплайсинга наблюдается  только после того, как закончится один из сложнейших процессов- транскрипция. Что касается первичного транскрипта, который является продуктом этого процесса, то есть транскрипции, то на нем следует остановиться более подробно. Дело в том, что сплайсинг затрагивает не только и-РНК, но и т-РНК. Так, около 40 из 400 ядерных генов т-РНК дрожжей имеют прерывистое строение и всегда в составе гена имеется один интрон, который расположен через один нуклеотид от 3^/-конца транспортной РНК (антикодона). Общая длина интрона составляет от 14 до 64 нуклеотидных пар. У различных по отношению к видам аминокислот т-РНК сходство совершенно отсутствует, тогда как у всех т-РНК, транспортирующих один и тот же вид аминокислоты, наблюдается полное сходство. Для того, чтобы проследить за сплайсингом, достаточно определить степень уменьшения размеров образовавшегося продукта и провести электрофорез, при котором изменяется положение полос и выделяется полоса интрона.

     В  клетках эукариот транскрипция генов, кодирующих белки, протекает в нуклеоплазме, однако образовавшаяся РНК в ядре отличается от зрелой и-РНК, которая покидает ядро и соединяется с рибосомами. Отличия затрагивают прежде всего размеры. У нуклеосомной РНК они значительно больше, а нуклеотидная последовательность их значительно усложнена. Такую РНК называют гяРНК (гетерогенно-ядерной). Нестабильность гяРНК не является результатом присутствия интронов и экзонов, а здесь кроются другие причины.

     В настоящее время имеются сведения о том, что освободившиеся интроны, принимая кольцевую форму, могут  выполнять функции вироидов.

     Явление транскрипции – это ферментативный процесс матричного синтеза и в нем участвует фермент РНК-полимераза, который состоит из четырех белковых (полипептидных) цепей: две α₂ – цепей и две развитых β и β₁  цепи. Это можно выразить общей формулой α₂ β β₁ . Если при такой структуре, которая называется корферментом, присоединяется σ-фактор (сигма-фактор), то образуется холофермент (РНК – полимераза+сигма-фактор). Общая формула холофермента будет выглядеть так α₂ β β₁ σ₅₅ . Субъединицы «сигма» имеют большие различия (σ_55, σ_37, σ_29, σqp_33-34 ). В клетках бактерии работают одни сигма-факторы, в структурах фагов – другие. Так, у фага сначала транскрибируются ранние гены с помощью сигма фактора σ₅₅ , через 4-5 минут средние, а на 8-12 минуте – поздние.