Проблемы моделирования трехмерной структуры белков. Методы их решения

ПЛАН РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………стр.3-4

ФОЛДИНГ………………………………………………………………………………..стр.5-6

СЛОЖНОСТИ МОДЕЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ………………………………………..стр.7-8

МЕТОДЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА…стр.9-14

ОГРАНИЧЕНИЯ СОПОСТАВИТЕЛЬНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ…………………стр.15

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………..стр.16

ЛИТЕРАТУРА……………………………………………………………………………стр.17

ВВЕДЕНИЕ.

Белки — универсальные биополимеры, из которых строится жизнь, — выполняют весь спектр биологических функций: от структурной до каталитической. Именно белки играют максимум ролей в живом мире, и важность их изучения не ограничивается только фундаментальной наукой: сегодня и медицина, и промышленность — потребители знаний о функциях и структуре белков.

Понимание механизмов функционирования живых систем, а значит, и возможность влиять на них, например, с помощью лекарственных средств, требует знания структуры белковых молекул и глубокого понимания их функций. Известно, что необходимая  информация заключена в линейной последовательности аминокислот пептидной цепочки, и что никакой дополнительной генетической информации, большей, чем та, которая заключена в ДНК, не требуется. Однако физико-химические аспекты этого сложнейшего процесса, называемого также фолдингом белка, остаются до сих пор понятыми лишь приблизительно.

Кроме учёных, структура белка интересует и специалистов более практического профиля. Фармацевты и врачи, например, заинтересованы в производстве и выпуске на рынок новых поколений лекарственных средств. Для этого нужно хорошо разбираться в молекулярных механизмах действия проектируемого лекарства, — направленного, скорее всего, на взаимодействие с каким-нибудь белком (рецептором или ферментом) в человеческом организме. Проектирование нового лекарства с учётом атомарного строения молекул-мишеней, на которые это лекарство будет действовать — наукоёмкий и сложный процесс, называемый драг-дизайном.

Разработка новых биотехнологических ферментов кроме знания структуры белков и понимания механизмов их работы, требует ещё умения проектировать новые функции в белках, ранее выполнявших какую-то другую работу.

ФОЛДИНГ

Фолдинг — сворачивание белков (и других биомакромолекул) из развёрнутой конформации в «нативную» форму — физико-химический процесс, в результате которого белки в своей естественной среде (растворе, цитоплазме или мембране) приобретают характерные только для них пространственную укладку и функции. С термодинамической точки зрения самосворачивание белка является переходом белковой молекулы в наиболее статистически вероятную конформацию (что практически можно приравнять к конформации с наименьшей потенциальной энергией). С кинетикой же фолдинга связывают так называемый парадокс Левинталя, согласно которому, если бы молекула белкá длиной хотя бы в 100 аминокислотных остатков «перебирала» все возможные конформации, прежде чем свернуться в нативную форму, этот процесс потребовал бы времени, превышающего время существования Вселенной. Однако из практики известно, что максимальное время сворачивания ограничивается минутами, типичное время — порядка миллисекунд, а кратчайший требуемый срок, зарегистрированный для трёхлистового β-слоя — всего 140 нс.

Решение парадокса Левинталя заключается в том, что молекула никогда не принимает подавляющего большинства теоретически возможных конформаций. Кооперативные эффекты фолдинга — одновременное формирование «зародышей» вторичной структуры, являющихся энергетически стабильными и уже не изменяющимися в процессе дальнейшего сворачивания — приводят к тому, что молекула белка находит «кратчайший путь» на воображаемой гиперплоскости потенциальной энергии к точке, соответствующей нативной конформации белка. Нативная конформация при этом отделена заметным энергетическим промежутком (potential energy gap) от подавляющего числа несвёрнутых форм, а ближайшая её окрестность определяет естественную конформационную подвижность молекулы.

Ограниченность понимания механизмов фолдинга связана ещё и с тем, что его сложно наблюдать экспериментально: это достаточно быстрый динамический процесс.

СЛОЖНОСТИ МОДЕЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

В настоящее время последовательности всех белков конвертируются из прочтённых геномов множества организмов в аннотированные базы данных, доступные через интернет. Так, число последовательностей в базе Swiss-Prot (версия 55.1 от 18 марта 2008 года), курируемой и аннотируемой специалистами вручную, составляет ≈360 000, а число записей в базе TrEMBL (версия 38.1), аннотированных автоматически по доступной геномной информации, приближается к 5.5 миллионам.

Инструментарием для решения  задачи определения пространственного строения белковых молекул  является  рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Эти методы ещё не достигли той степени зрелости, чтобы можно было получить структуру любого интересующего исследователей белка с ограниченными временными и материальными затратами.

Сложность заключается в получении нужных количеств белка, подготовке препарата, пригодного для изучения дифракции рентгеновских лучей или ядерного магнитного резонанса в меченном изотопами образце, и в анализе данных. Каждый этап этой задачи часто требует уникального подхода и поэтому не может быть полностью автоматизирован. Особенно сложно охарактеризовать структуру белков, образующих сложные молекулярные комплексы, и интегральные белки биологических мембран (составляющих до трети от общего числа белков в большинстве организмов). Поэтому, даже с учётом того, что расшифровкой структур белков занимаются не только научные коллективы по собственной инициативе, но и международный консорциум PSI (Protein Structure Initiative), задачей которого является максимально полная и широкая структурная характеризация всего белкового разнообразия в живом мире, число белков с известной структурой сравнительно невелико. По состоянию на 22 декабря 2009, число структур в Брукхэйвенском банке белковых структур (PDB) ≈ 57 000, но если из этого множества исключить повторные эксперименты на одних и тех же белках в различных условиях, а также структуры искусственно модифицированных и близкородственных белков, это число сократится до менее чем 10 000, составляя ≈1–2% от общего числа практически важных белков.

Выход из сложившейся ситуации могут дать методики теоретического предсказания пространственной структуры, решающим преимуществом которых является сравнительно высокая скорость и низкая трудоёмкость получения моделей строения белков. Оборотной стороной этого преимущества оказывается «качество» моделей — точность предсказания, которая не всегда является достаточной для практически важных задач (например, изучения взаимодействия рецептора с лигандами). Однако в условиях ограниченной доступности структурных данных по интересующему исследователей объекту, молекулярная модель оказывается разумной заменой — особенно учитывая тот факт, что более или менее реалистичные модели могут быть построены для >50% всех белков с неизвестной структурой.

МЕТОДЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА

1.Распознавание фолда с использованием библиотеки известных фолдов

Распознавание фолда – это первая стадия для построения модели трехмерной структуры белка. Применяется, если отсутствует информация о близких гомологах исследуемого белка, пространственная структура которых расшифрована ранее. При этом удается предсказать корректно укладку для ~75% белков.  Точности построенной на базе этого метода модели недостаточно, чтобы исследовать механизмы функционирования макромолекулы и, в конечном счете, создаваемой молекулярной системы.

2.Предсказание архитектуры белковой глобулы на основе знаний об атомных воздействиях (метод ab initio или de novo)

Этот термин означает, что в предсказании не используют в явном виде информации о структуре других белков. Все вычисления, как правило, производятся в эмпирических силовых полях, описывающих парные взаимодействия в классической системе частиц, представляющей молекулу белка. Сами же эти силовые поля в неявном виде включают данные о структуре молекул (не обязательно белковых) — такие как парциальные заряды и массу атомов, а также длины и углы валентных связей, — и к квантово-механическим методам отношения не имеют.

Наиболее «физически корректные» подходы из этой группы заключаются в основном в расчётах МД для моделирования процесса и результата фолдинга, однако эти методы из-за их огромной вычислительной сложности и неточности функций потенциальной энергии достигают успеха лишь для некоторых очень небольших белков. В остальных же случаях — тоже, относящихся к маленьким белкам (не более 150 аминокислотных остатков), — прибегают к дополнительным приближениям с целью уменьшить вычислительную сложность расчёта.

Для увеличения вычислительной эффективности, в de novo подходах часто используются упрощённые модели представления белка — отдельные аминокислотные остатки, присутствующие в модели, представлены не так подробно, как в полноатомных подходах: вся боковая цепь моделируется лишь одним-двумя центрами («псевдоатомами»). De novo фолдинг проводится в специальном силовом поле, оценивая огромное количество вариантов укладки сворачиваемой молекулы по значению потенциальной энергии. Идентификация конформации, значительно более «низкой» по потенциальной энергии, чем остальные, может служить признаком конца поиска — аналогично тому, как нативная конформация с некоторым отрывом отстоит от несвёрнутых промежуточных состояний.

Чтобы как-то приблизиться к природному механизму сворачивания, исследователи пытаются выделить в последовательности моделируемого белка структурно консервативные фрагменты (аналогичные тем, что в природе сворачиваются первыми и в дальнейшем уже остаются неизменными) и как бы «собирают мозаику» из этих фрагментов. Эта процедура позволяет существенно сократить время расчётов.

Одним из научных коллективов, активно занимающихся предсказанием структуры белков de novo, является вашингтонская лаборатория Дэвида Бэйкера. Разрабатываемая ими программа Rosetta генерирует ансамбль моделей, получающихся после «сборки» структурно-консервативных фрагментов молекулы в специализированном силовом поле. Короткие (4–10 аминокислотных остатков) фрагменты последовательности моделируемого белка выступают «зародышами» структуры будущей, а конформацию этим фрагментам «назначают», используя конформации гомологичных фрагментов из белков с уже известной структурой. Программа TASSER использует похожий подход. Короткие структурные фрагменты «собираются» в специализированном силовом поле, а результат (модель, предположительно близкая к нативной) выбирается из ансамбля предсказаний с помощью идентификации наиболее плотного структурного кластера — являющегося, по мнению исследователей, «гнездом» физически реалистичных моделей.

3.Моделирование по гомологии

Многие белки имеют типичные мотивы пространственной организации — то есть, принадлежат к различным семействам, образуя родственные группы. Все белки с известной структурой подразделяются на ≈3 500 структурных семейств, образующих ≈1000 типов пространственной укладки (согласно классификации SCOP — Structural Classification of Proteins).

Родство между белками (обычно измеряемое степенью идентичности их аминокислотных последовательностей) не случайно: одна из наиболее распространённых гипотез белковой эволюции объясняет «родственные отношения» дупликацией генов, произошедшей когда-то в процессе эволюции организма и приведшей к появлению белка с новой функцией.

Эмпирически установлено, что если последовательности двух белков идентичны друг другу более чем на 30%, то белки почти наверняка являются «родственниками» и степень эволюционной дивергенции ещё не столь велика, чтобы их структуры утратили общность. Эти наблюдения и являются основой методики предсказания пространственной структуры, называемой моделированием на основании гомологии.

На настоящий момент моделирование по гомологии позволяет установить структуру более половины белков, чьё строение ещё неизвестно. Если же выбирать мишени для экспериментального определения структуры таким образом, чтобы в результате для каждого белка был получен хотя бы один структурный гомолог (с идентичностью последовательностей >30%), то окажется, что достаточно получить всего 16 000 структур, а «степень покрытия» при этом составит >90%, включая и мембранные белки. Моделирование по гомологии в этом случае поможет установить структуры большей части оставшихся белков.

Процесс моделирования по гомологии включает несколько шагов, главными из которых являются поиск структурного шаблона и построение аминокислотного выравнивания. Решающим фактором, определяющим качество получаемых моделей, является степень гомологии (или идентичности) последовательностей моделируемого белка и шаблона. Высокая идентичность обозначает, что эволюционное расхождение обоих белков от общего «предка» произошло не настолько давно, чтобы эти белки утратили структурную общность.

Схема моделирования по гомологии:

        Идентификация структурного шаблона — белка с известной пространственной структурой, гомологичного моделируемому (идентичность последовательностей >30%). Поиск производится с помощью серверов FASTA или PSI-BLAST (или их аналогов) в базе структур белков PDB (едином депозитарии структурных данных для биомакромолекул);

        Построение выравнивания аминокислотных последовательностей шаблон-модель. Парное выравнивание служит «инструкцией» программам, осуществляющим моделирование. Множественное выравнивание может быть полезно для выявления консервативных остатков во всём семействе (показаны звёздочкой) или отдельных подсемействах белков (три верхних последовательности — рецепторы мелатонина). Множественное выравнивание и профили последовательностей позволяют идентифицировать более слабые гомологии, чем «обыкновенное» парное выравнивание. Выравнивание проводят с помощью сервера CLUSTALW (или его аналогов);