Криоконсервация. Банки гибридом. Применение моноклональных антител

ОМСКАЯ  ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Кафедра промышленной технологии с курсом биотехнологии 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Реферат на тему:

«Криоконсервация. Банки гибридом. Применение моноклональных антител». 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выполнила: студентка 577гр. Фармацевтического факультета Лупенко А. П. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Омск, 2008 г.

Содержание:

1. Введение.
2. Криоконсервация

•     Что такое криоконсервация
•     История
•     Применяемые методы
•     Применяемое оборудование

3. Банки гибридом

• Что такое гибридомы
• Создание гибридом
• Институт цитологии российской академии наук

4. Применение моноклональных антител

• Что такое моноклональные антитела
• Метод получения
• Применение

   5. Заключение 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    1.Введение

    Люди  давным-давно отметили, что любые  продукты питания растительного  и животного происхождения значительно лучше сохраняются в охлаждённом и замороженном состоянии, при этом исключается их гниение, заражение плесневыми грибами и т.п. Но при этом люди замечали, что слишком долго хранить продукты охлаждёнными либо замороженными тоже нельзя – они теряют влагу, полезные вещества постепенно разлагаются, а после разморозки так и вообще теряют структуру. Последнее обусловлено образованием кристалликов льда в клетках (как животных, так и растительных), которые, увеличиваясь в объёме и имея острые грани, разрывают клеточные мембраны, нарушая клеточную структуру тканей.

    В медицине к середине ХХ-го века накопилось достаточно проблем, решение которых  заключалось бы в долгом сохранении нативных качеств клеток и тканей in vitro. Мысли учёных обратились к методам заморозки. Но попытки замораживания культур клеток и тканей долгое время оставались безуспешными по той же причине образования кристалликов льда внутри клеток.

    Решение однако всё же было найдено –  в методах криоконсервации, обеспечивших значительный прогресс биотехнологии, производства лекарственных препаратов и медицины. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    2.Криоконсервация.

    2.1.Что  такое криоконсервация.

    Криоконсервация - процесс хранения органов, тканей или отдельных клеток при пониженной температуре.

    Наилучшие условия для криоконсервации создаются при температуре жидкого азота, минус 196 градусов Цельсия. Криоконсервация позволяет создать клеточный "банк запасных частей", необходимых для восстановления жизненных функций организма, нарушенных в результате заболевания или в процессе его лечения. Криоконсервации могут быть подвергнуты и стволовые клетки пуповинной крови, полученные при рождении человека. В этих условиях стволовые клетки могут храниться десятилетиями. В последующие годы они могут быть извлечены из криогенного хранилища, разморожены и использованы для новых способов лечения заболеваний.

    2.1.История.

    В большей степени учёных интересовало сохранение половых клеток животных и человека – для селекции пород  животных и для лечения бесплодия  человека.

    Отдельные попытки сохранения в замороженном состоянии яйцеклеток и сперматозоидов животных предпринимались еще 200 лет назад. Но только с 1949 года, когда Польдж с коллегами открыли защитные свойства глицерина, криоконсервация спермы стала реальностью.  Яйцеклетки, эмбрионы и ткань яичников сохранить длительное время не удавалось. Лишь с введением других реагентов (ДМСО и пропандиол), гораздо позже, наконец удалось удачно провести замораживание и размораживание сначала эмбрионов (Вайтенгем в 1972 году), а затем и зрелых ооцитов (Фрайдлер в 1988 году) млекопитающих. Первая беременность из замороженного и размороженного эмбриона человека была получена в 1983 году (Троунсон и Мор). К 2000 году наиболее распространенным подходом к криоконсервации эмбрионов оказался метод замораживания эмбриона на стадии зиготы. В этом случае выживаемость эмбрионов имеет наиболее высокие показатели и достигает 60-80%. Частота имплантации эмбрионов достигает тех же значений, что и у свежих эмбрионов - 10-15%. Во многих странах используется также криоконсервация эмбрионов на стадии дробления. В зависимости от качества эмбрионов после оттаивания в этом случае выживают около 30-80 % эмбрионов.

    Криоконсервация неоплодотворенных зрелых ооцитов  и яичниковой ткани человека,  тем не менее, до настоящего времени остается еще мало решенной проблемой.   Сложность криоконсервации зрелых ооцитов связана с тем, что при замораживании на этой стадии часто повреждаются веретена мейотического деления, что ведет к анеуплоидии.  Частота наступления беременности после криоконсервации ооцитов человека составляет всего 1% и таким образом, не достаточна для клинического применения. Лишь в 2000 году впервые было сообщено об успешной криоконсервации ткани яичника человека. По данным авторов, фолликулы нормально развивались в кусочках яичниковой ткани, которая была взята, заморожена и подсажена у одной и той же пациентки.

    2.3.Применяемые  методы.

    Суть  всех методов сводится к решению  главной проблемы – избежание  образования кристалликов льда внутри клеток. Главная задача, которую нужно решить при замораживании, заключается, поэтому,  в обезвоживании клетки. Однако, удаление слишком большого количества воды также губительно для нее.   Точка замораживания воды, содержащей различные ионы, находится ниже 0°C и зависит от концентрации растворенных веществ. При замораживании клетки часть молекул воды в ней начинает кристаллизоваться, и это еще больше повышает концентрацию раствора, что в свою очередь снижает точку замораживания.   Возрастание осмотического давления является также губительным для клетки. В настоящее время общепризнанно, что повреждение клетки происходит не из-за низкой температуры как таковой, а из-за образования кристалликов льда в определенных температурных зонах при замораживании и оттаивании.

    В том случае, если производится медленное замораживание клеток, их содержимое  может сохраниться в жидком состоянии при  температуре значительно более низкой, чем   точка замерзания соответствующего раствора.  Этот феномен известен под названием - супер-охлаждение. Солевой раствор на фосфатном буфере с добавлением ДМСО имеет точку замерзания -3°C. При медленном замораживании такой раствор можно охладить до состояния супер-охлаждения при температуре -21°C без образования льда. Замораживание обычно производят в специальных программируемых аппаратах, которые точно поддерживают скорость охлаждения и нужные температурные режимы. Этот метод называется методом контролируемой заморозки и оттаивания эмбрионов. С целью предотвращения спонтанного образования льда, он включает в себя очень важный этап, который называется сидинг. Под сидингом подразумевают индукцию образования кристалликов льда при температуре несколько меньшей точки замораживания, что также предотвращает сверх-охлаждение.    Сидинг обычно выполняется при температурах -5  - 7°C вручную путем прикосновения пинцетом или другим предметом к соломинке содержащей раствор с клетками.

    Температура при которой заканчивается медленное  замораживание и материал переносится  в жидкий азот  влияет на степень  дегидратации клеток. Так, клетки, охлажденные медленно до температуры - 60°C имеют высокую степень дегидратации и требуют медленного оттаивания (8 - 20°C/минуту) с целью обеспечения адекватной регидратации. Наоборот, клетки, охлажденные медленно только до  -30  - 40°C должны оттаивать быстро (275 - 500°C/минуту). При оттаивании клеток фактически решают две задачи - это регидратация клетки и удаление криопротектанта, находящегося в клетке. Чтобы избежать осмотического шока от быстрой регидратации, размораживаемый эмбрион помещается поэтапно в несколько растворов содержащих все более низкие концентрации криопротектанта.

    Очень низкий процент успеха достигаемый  при замораживании зрелых ооцитов  стимулировал поиск совершенно новых  подходов. Большие надежды возлагаются  на разрабатываемый в настоящее  время метод ультрабыстрого замораживания. Пробные исследования составов реагентов и условий ультрабыстрой криоконсервации начались еще с середины 80-х годов. На сегодня  этот подход получил  значительное развитие и возможно в ближайшие годы он будет приобретать все большее значение в репродуктивных технологиях. При ультрабыстрой криоконсервации происходит витрификация цитоплазмы, что означает замораживание без образования кристалликов льда.

    Витрифика́ция (стеклование)(от лат. Vitrum — стекло и лат. facio — делаю, превращаю, то же что стеклование) – это переход жидкости при понижении температуры в стеклообразное состояние.

    Для витрификации необходимо избежать образование  кристаллической фазы при охлаждении. Практически любой расплав можно  витрифицировать, т.е. перевести в стеклообразное состояние. Некоторые расплавы (такие как стеклообразующих веществ) не требуют для этого быстрого охлаждения. Напротив, расплавы металлов требуют для витрификации (получения металлических стекол) чрезвычайно быстрое охлаждение. В биотехнологии витрификация может наступать в живых организмах при медленном охлаждении, с восстановлением жизнедеятельности при обратном нагреве.

    Метод требует высоких концентраций хорошо проникающего сквозь мембрану криоконсерванта  в сочетании с малопроникающими растворами для дегидратации клеток.  Витрификация заключается в помещении клеток на короткое время (чтобы избежать токсического действия)  в витрификационную среду с последующим замораживанием с очень высокой скоростью. Витрификационные среды обычно содержат высокие концентрации этилен гликоля (40%), фикола (18%) и сахарозы (10%) или только этиленгликоля и сахарозы.  Первые сообщения об успешном применении метода для замораживания ооцитов  с последующим рождением  детей уже появились начиная с  1999 года. 

    Недавно японскими исследователями во главе с доктором Masashige Kuwayama был изобретён новый метод криоконсервации Cryotop. Новая методика позволяет замораживать овоцит в крошечном количестве специального раствора очень быстро, с последующим хранением в жидком азоте, что предотвращает формирование ледяных кристаллов, которые могут повредить структуру яйцеклетки. Если ранее процент выживания эмбрионов и овоцитов после разморозки составлял лишь около 50%, то новый метод позволил увеличить это значение до 94,5%. Число беременностей после оплодотворения в пробирке составило 41.9 %, и оказалось сопоставимо с 42.5 %, при использовании овоцитов без заморозки.

    Но  в рамках всей биотехнологии криоконсервации  подвергаются не только клетки тканей человека, но всевозможные штаммы бактерий и грибов, культуры растительных и животных клеток – всё то, что может послужить основой для восстановления редких видов растений и животных, селекции новых пород, сортов и штаммов, производства различных лекарственных, в т.ч. иммунологических, препаратов.

    Методы  криоконсервации:

1. Криоконсервация в глицерине при - 196 С^о с высокой скоростью охлаждения.
2. Криоконсервация в сахарозе при - 196 С^о с высокой скоростью охлаждения.
3. Криоконсервация в сахарозо-желатиновом агаре при - 196 С^о с высокой скоростью охлаждения.
4. Криоконсервация на дисках плотной среды в глицерине при - 196 С^о с высокой скоростью охлаждения.
5. Криоконсервация при - 196 С^о с медленной скоростью охлаждения.
6. Криоконсервация при -196 С^о со средней скоростью охлаждения.
7. Криоконсервация на силикагеле.
8. Криоконсервация при -70 С^о.
9. Криоконсервация при -70 С^о на фильтровальной бумаге.
10. Криоконсервация при температурах от -10 до -18 С^о в пробирках.
11. Криоконсервация с помощью сухого льда (СО₂).

    Выбор метода для культуры клеток диктуется свойствами самой культуры клеток. Последний метод отличается простотой исполнения и оборудования, но применяется в основном для криоконсервации спермы.

    2.4.Применяемое  оборудование.

    Культуры  клеток непосредственно замораживаются и хранятся в пробирках или в соломинках (чаще) из полимерных материалов: полипропилена, силикона и др. На пробирку или соломинку обязательно наносится маркировка краской, устойчивой к большим температурным перепадам.