НИЯУ МИФИ

Кафедра общей  и специальной химии

Реферат на тему :

Использование хроматографических методов в спортивной медицине. Допинг-контроль.

Выполнила:

Группа ХИМ-07

Деревщикова Полина

Проверила:

Хомушку Г.М.

Обнинск 2011

 

   Допинги – это лекарственные препараты, которые применяются спортсменами для искусственного, принудительного повышения работоспособности в период учебно-тренировочного процесса и соревновательной деятельности. В зависимости от вида спорта они могут обладать совершенно различными и даже противоположными фармакологическими действиями: от психостимулирующего до транквилизирующего, от мочегонного до кардиотропного влияния.

   К допингам относятся все психостимуляторы, дыхательные аналептики, адреномиметики, холиномиметики, антихолинэстеразные средства, антидепрессанты, наркотические аналгетики, сердечные гликозиды, тестостерон и анаболические стероиды, кортикостероиды, пептидные гормоны, гонадотропины, эритропоэтин и другие. Кроме того, во всех видах стрельбы запрещены бета-блокаторы, оксибутират натрия, транквилизаторы, снотворные средства, марихуана, гашиш и алкоголь, а для исключения маскировки стероидов, их ускоренного выведения – мочегонные средства. Ко всем группам лекарственных средств в списке запрещенных препаратов есть добавление: «и другие родственные соединения». Это означает, что может быть обнаружен и неизвестный допинг как по химической структуре, так и по фармакологическому действию. 

   Анаболические стероиды, такие как тестостерон, используются для наращивания мышц, анальгетики (включая наркотики, такие как морфий) позволяют получившим травмы спортсменам продолжать тренировки, диуретики увеличивают образование мочи и, таким образом, уменьшают концентрацию лекарственных средств в образцах, пептидные гормоны, такие как гормон роста, стимулирют рост тканей, стимулянты (включая кофеин) усиливают выносливость. В том случае, если обнаруживается присутствие в биологических жидкостях атлета запрещенных к применению соединений, не вырабатываемых организмом, он не проходит тест. В качестве примера можно привести идентификацию присутствия кокаина или амфетамина или их метаболитов. Тестостерон является естественным гормоном, но может работать как анаболический агент. Для ограничения неправомерного использования тестостерона официальные Олимпийские организации установили разрешенный предел отношения концентрации тестостерона к эпитестостерону в моче (эпитестостерон - естественный гормон, не являющийся анаболическим стероидом, метаболит тестостерона), равный 6 к 1. Для большинства мужчин естественное отношение этих гормонов 1 к 1, но у некоторых атлетов это отношение является более низким естественным путем. Это, естественно, является основанием для атлетов (мужчин) с более низким естественным отношением принимать тестостерон в больших количествах прежде чем будет достигнуто разрешенное отношение 6 к 1. Другой возможностью является использование средств, ведущих к мобилизации сил или повышению выносливости, которые еще не внесены в список соединений, запрещенных к использованию.

   Новейшие методы фармакокинетического (физико-химического) анализа позволяют с большой точность констатировать наличие в моче или крови самого препарата, а также его метаболитов. Метаболиты некоторых препаратов, которые очень быстро трансформируются в организме (например, пемолин), являются маркерами приема допинга.

   Наиболее информативными в экспертизе на допинг считаются хромато-масс-спектрометрия повышенной разрешающей способности, а также газовая и жидкостная хроматография, флуоресцентный иммунный анализ, радиоиммунный анализ и инфракрасная спектрометрия.

   Допинговый контроль обнаруживает очень низкие концентрации допинговых веществ и(или) их метаболитов. Анализ на применение анаболических стероидов остается положительным даже при ускоренном выведении этих веществ на фоне потребления большого количества лимонов, сухого вина и других маскирующих средств со сложной циклической химической структурой или мочегонных препаратов.

 
   Анаболические стероиды, анальгетики, диуретики и стимулянты анализируются методом хромато-масс-спектрометрии. Этот анализ позволяет определять анаболические стероиды на уровне долей на миллиард  даже в присутствии в сложных матрицах, таких как моча. Кортикостероиды, либо принятые человеком, либо выработанные организмом пептидным гормоном кортикотрофином, определяются с помощью сочетания высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектроскопическим детектированием. Запрещенный пептидные гормоны идентифицируются с помощью методов иммуно-ферментного анализа.

Далее я приведу  несколько примеров анализа конкретных соединений.

Анализ триметилсилильных производных гидроксистанозолола методом газовой хроматографии с применением масс-спектроскопического детектора.

   Метод ГХ/МС комбинирует высочайшую селективность с чувствительностью, что обеспечивает надежное детектирование соединений, использование которых атлетами контролируется Международным Олимпийским Комитетом. Ниже приводится пример анализа триметилсилильных производных 3'-OH станозолола, экстрагированного из мочи на уровне концентрации менее 1 нг/мл.

 
Хроматограмма экстракта из мочи атлета

 

спектр 3'-OH станозолола 

Анализ амфетамина 
с использованием хромато-масс-спектрометрии с детектированием отрицательных ионов, образующихся при химической ионизации.

   Амфетамин, стимулянт нервной системы, более не используется в терапевтической практике вследствие наличия побочных действий. Сегодня более широкое распространение этот препарат получил как наркотик.

   Дериватизация амфетамина в пентафторбензиловый эфир (PFBZ) в сочетании с высокой чувствительностью квадрупольного хромато-масс-спектрометра Automass позволяет определять предельно низкие концентрации на уровне 100 фг/мкл в режиме регистрации отрицательных ионов при химической ионизации.

   Аutomass Multi - это первый в мире настольный хромато-масс-спектрометр - трансформер. Этот прибор может работать как в режиме газовой хроматографии, так и в режиме жидкостной хроматографии, при этом переход от одного режима к другому занимает не более 10 минут. Это единственный в мире прибор, возможности которого могут постоянно наращиваться.  Преимуществом этого прибора является то, что сначала можно купить дешевый хроматограф, а затем, при появлении новых задач, устанавливать на него дополнительные системы: режим химической ионизации, прямой ввод пробы, и даже интерфейс для работы с жидкостным хроматографом. При этом установка всех этих систем исключительно проста и может проводиться самим владельцем прибора.   

 

Масс-спектр отрицательных ионов 10 пг амфетамина. Наибольший пик с 309 а.е.м. соответствует отрыву фрагмента HF от молекулярного иона (329 а.е.м.). 

   Условия хроматографирования: колонка DB-1 длиной 15 м, внутренний диаметр составляет 0.25 мм, толщина пленки фазы - 0.25 мкм, температура инжектора хроматографа - 250^оС, температурная программа изотерма - 70^оС/1 мин, подъем осуществляется со скоростью 40^оС/мин до 120^оС, затем 15^оС/мин до 270^оС. Масс-спектрометр в режиме записи полного спектра в диапазоне масс 100 - 600 а.е.м. за 0.6 сек.

   Высокая чувствительность и селективность прибора и метода ионизации позволяет рутинно измерять концентрации на уровне 100 фг/мкл амфетамина в режиме селективного мониторинга единичного иона, характеризующего данное соединение в сложных матрицах.

 

             Анализ и подтверждение применения синтетического тестостерона 
 
   Прием синтетического тестостерона определяется путем измерения отношения тестостерон/эпитестостерон (Т/Е) с использованием ГХ/МС. Подтверждение выполняется методом газовой хроматографии - изотопной масс-спектрометрии. Поскольку синтетический тестостерон быстро выделяется с мочой, что видно из графика отношения Т/Е (сплошная кривая), отношение изотопов углерода ¹³C/¹²C (d¹³C) позволяет детектировать синтетический тестостерон в течение гораздо большего периода времени вследствие подавления выработки тестостерона организмом. Отношение ¹³C/¹²C для синтетического тестостерона отличается от отношения для эногеного тестостерона. Человеческий организм возвращается к нормальной выработке эндогенного тестостерона и отношение ¹³C/¹²C возвращается к норме с задержкой в почти 12 часов.

 
Сравнение отношения T/E (тестостерон/эпитестостерон) и величин d¹³C, определяемых на ГХ/изотопном масс-спектрометре после приема 40 мг ундеканата-тестостерона. Пунктирная линия показывает диапазон прямого определения синтетического тестостерона в моче. 

Определение новых классов  допинговых соединений методами хроматографии  и масс-спектрометрии  

   Новые препараты в любой момент могут появиться в спорте высших достижений как допинговые средства. Разработка методик с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) и масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ/МСВР) для определения новых допинговых препаратов в биологических средах человека является актуальной задачей. Важным аспектом превентивных исследований в области допингового контроля является включение новейших субстанций, которые потенциально возможно использовать в качестве допинга, в аналитическую практику.  

   В результате ежедневного приема 3 мг производного арилпропионамида - остарина - в течение 3 месяцев у добровольцев наряду с наращиванием мышечной массы на 1,4 кг наблюдали увеличение силовых качеств и выносливости без особых диет и физических нагрузок. При этом активизируются только андрогенные рецепторы в тканях-мишенях, таких как мускулы и кости, в то время как стимуляция рецепторов в других органах, например в простате, не затрагивается, или подавляется. Этот модификатор имеет малый период полувыведения у людей - 4 часа, и к настоящему времени он прошел только вторую стадию клинических испытаний на людях. Отмечено, что его прием не вызывает задержку воды в организме. Скорее всего, данный препарат будет использоваться спортсменами на заключительных этапах подготовки перед соревнованиями, например тяжелоатлетами и культуристами. В ближайшие годы можно ожидать, что остарин станет широко распространенным допинговым препаратом и будет продаваться на черном рынке.  

   Из-за селективной природы этого нестероидного соединения не наблюдаются побочные эффекты, характерные для гормональной заместительной терапии. Остарин обладает анаболическим эффектом, сравнимым с тестостероном. Селективные модуляторы андрогенных рецепторов (САРМы) действуют более селективно и обладают высокой биодоступностью, что открывает широкие перспективы для их клинического использования. Кроме того, эти соединения проявляют анаболическую активность, влияя на андрогенные рецепторы, ответственные за рост мышечных волокон, что приводит к росту мышечной массы и силы.   

   Область исследования и разработок САРМов постоянно пополняется данными о результатах in vivo экспериментов с разнообразными структурными матрицами.  

   Другая группа препаратов, увеличивающая мышечную массу вместе с выносливостью за счет изменения метаболических процессов в мышечных тканях животных -агонисты дельта-рецепторов активации пролиферации пероксисом.  

   Употребление агонистов рассматривается ВАДА (всемирное антидопинговое агенство) как применение генного допинга. Агонисты проходят клинические испытания как средства для лечения ожирения и нормализации уровня холестерина и пока не имеют патентованных названий, только кодовые номера. Механизм действия этих соединений принципиально отличается от действия анаболических стероидов, увеличивающих мышечную массу без повышения выносливости.  

   Семейство ядерных рецепторов участвует в регуляции множества генов в различных метаболически активных тканях. Они участвуют в систематической регуляции метаболизма жиров, выступая в качестве сенсоров жирных кислот, эйкозаноидов, простагландинов и родственных им метаболитов. Последние исследования с использованием сильного и селективного агониста - GW501516 - показали, что активация данного подтипа может вызвать обратный транспорт холестерина и выравнивание профиля липопротеинов и уровня триглицеридов. Агонисты также влияют на образование плаценты, процессы ожирения, колоректальный рак и факторы диабета.