Понятие о ферментах

ПОНЯТИЕ О ФЕРМЕНТАХ

Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного множества разнообразных химических соединений. Жизнь и многообразие ее проявлений – сложная совокупность химических реакций, катализируемых специфическими ферментами. И.П. Павлов считал ферменты «возбудителями всех химических превращений» у живых существ. Как известно, важнейшим свойством живого организма является обмен веществ, ускоряющим аппаратом, основой молекулярных механизмов интенсивности которого являются ферменты. «Вся тайна животной жизни,– писал Д.И. Менделеев,– заключается в непрерывных химических превращениях веществ, входящих в состав животных тканей».

В настоящее  время теоретические и практические достижения энзимо-логии используются в решении многих проблем биохимии и молекулярной биологии, включая их сравнительное и эволюционное рассмотрение. «Под знаком молекулярной энзимологии,– говорил на III Всесоюзном биохимическом съезде (1974) А.Е. Браунштейн,– развивается и встречное течение – реконструкция или интеграция, восходящая от молекулярного яруса к высшим уровням структурно-функциональной организации живого и пронизывающая весь комплекс актуальных проблем биологии и медицины».

Ферменты обеспечивают осуществление таких важнейших процессов жизнедеятельности, как экспрессия (реализация) наследственной информации, биоэнергетика, синтез и распад биомолекул (обмен веществ). Изучение их способствует проникновению в суть и сокровенные тайны того загадочного явления, которое мы называем жизнью. Этими обстоятельствами может быть объяснено пристальное внимание исследователей к проблемам структуры, функций и молекулярных механизмов действия ферментов.

От неорганических катализаторов ферменты отличаются рядом характерных особенностей. Прежде всего ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют в миллионы и миллиарды раз более высокую каталитическую активность в условиях умеренной температуры (температура тела), нормального давления и в области близких к нейтральным значениям рН среды.

Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в отношении как химической природы субстрата, так и типа реакции, т.е. каждый фермент катализирует в основном только определенную химическую реакцию. Для каждого фермента характерны специфическая последовательность расположения аминокислотных остатков и пространственная кон-формация. Существенной особенностью ферментов является также то, что их активность в клетках строго контролируется как на генетическом уровне,

Рис. 4.1. Области применения ферментов в биологии и медицине (по Грину).

так и посредством определенных низкомолекулярных соединений, в частности субстратов и продуктов реакций, катализируемых этими же ферментами, ингибиторов и др. Таким образом, молекула фермента характеризуется уникальностью структуры, которая и определяет уникальность ее функции.

Учение  о ферментах выделено в самостоятельную науку – энзимологию. Термин «энзим» (от греч. en zyme – в дрожжах), так же как и «фермент» (от лат. fermentatio – брожение), означает процесс, связанный с выделением газов, брожением.

В настоящее  время учреждены научно-исследовательские  институты по изучению ферментов, издаются специальные журналы, созываются национальные и международные симпозиумы и конференции, посвященные проблемам энзимологии. Наука о ферментах интенсивно развивается в тесной связи со многими науками, в частности с органической, неорганической и физической химией, физиологией, токсикологией, микробиологией, генетикой, фармакологией и др. Таким образом, эта область знаний находится на стыке химических, биологических и медицинских наук.

Энзимология в  ее современном физико-химическом и  молекулярном понимании решает две  главные, неразрывно связанные между  собой проблемы: определение структурной  макромолекулярной организации ферментов и изучение природы химических взаимодействий, лежащих в основе ферментативного катализа. Накопление экспериментальных данных и развитие теоретических представлений происходят настолько быстро, что любой учебник к моменту выхода в свет уже не отражает достаточно полно современное состояние вопроса о структуре и функциях ферментов.

Важно подчеркнуть, что изучение ферментов имеет огромное значение для любой фундаментальной и прикладной области биологии, а также для многих практических отраслей химической, пищевой и фармацевтической индустрии, занятых приготовлением катализаторов, антибиотиков, витаминов и многих других биологически активных веществ, используемых в народном хозяйстве и медицине (рис. 4.1). В фармакологии действие многих лекарственных препаратов основано на определенном, хотя часто еще не выявленном, механизме взаимодействия их с ферментами. Успехи общей и молекулярной энзимологии способствуют развитию новой ее ветви – медицинской энзимологии, цели и задачи, методологические подходы которой связаны с решением проблем энзимопатологии, энзимо-диагностики и энзимотерапии (см. далее). Наука о питании базируется на точных знаниях поэтапного расщепления питательных веществ под влиянием ферментов пищеварительного аппарата, на количественный и качественный состав которых существенное влияние оказывает характер поступающих с пищей веществ. Многие проблемы наследственной патологии человека, развитие врожденных пороков обмена тесно связаны с дефектами или полным отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы клеточного роста и развития, дифференцировки клеток высших организмов, физиологических функций (движение, перемещение в пространстве, транспорт веществ и ионов, процессы возбуждения и торможения и др.) определяются в большой степени работой биокатализаторов, включая их биосинтез и инактивацию. Таким образом, есть все основания для подтверждения положения, что не только современная биология, как отмечает акад. А.Е. Браунштейн, но и медицина «говорит на языке энзимологии».

Строение  ферментов

Субстратом (S) называют вещество, химические превращения которого в продукт (Р) катализирует фермент (Е). Тот участок поверхности молекулы фермента, который непосредственно  взаимодействует с молекулой  субстрата, называется активным центром  фермента.

Активный центр  фермента образован из остатков аминокислот, находящихся в составе различных  участков полипептидной цепи или  различных полипептидных цепей, пространственно сближенных. Образуется на уровне третичной структуры белка-фермента.

В его пределах различают Адсорбционный участок (центр) и каталитический участок (центр). Кроме того, вне активного центра фермента встречаются особые функциональные участки; каждый из них обозначают термином аллостерический центр.

Каталитический центр - это та область (зона) активного центра фермента, которая непосредственно участвует в химических преобразованиях субстрата. Формируется он за счет радикалов двух, иногда трех аминокислот, расположенных в разных местах полипептидной цепи фермента, но пространственно сближенных между собой за счет изгибов этой цепи. Например, каталитический центр "серин-гистидиновых" ферментов формируется за счет радикалов аминокислот серина и гистидина. Если фермент является сложным белком, то в формировании каталитического центра нередко участвует простетическая группа молекулы фермента (кофермент). Коферментную функцию выполняют все водорастворимые витамины и жирорастворимый витамин K.

Адсорбционный центр - это участок активного центра молекулы фермента, на котором происходит сорбция (связывание) молекулы субстрата. Он формируется одним, двумя, чаще тремя радикалами аминокислот, которые обычно расположены рядом с каталитическим центром. Главная его функция - связывание молекулы субстрата и передача этой молекулы каталитическому центру в наиболее удобном положении (для каталитического центра). Эта сорбция происходит только за счет слабых типов связей и потому является обратимой. По мере формирования этих связей происходит конформационная перестройка адсорбционного центра, которая приводит к более тесному сближению субстрата и активного центра фермента, более точному соответствию между их пространственными конфигурациями. Такое соответствие - не заранее "готовое", а формирующееся в ходе взаимодействия - американский ученый Кошленд положил в основу теории индуцированного соответствия (или наведенного соответствия), которая преодолела ограниченность существовавшей ранее теории ключа и замка (жесткого соответствия структуры субстрата структуре адсорбционного центра).

Очевидно, что  именно структура адсорбционного центра определяет субстратную специфичность  фермента, т. е. требования фермента к  молекуле химического вещества, чтобы  она могла стать для него подходящим субстратом.

Некоторые вещества, обладающие подходящими характеристиками (т. е. похожие на субстрат), могут  тоже связываться с адсорбционным  центром фермента. Но если в их молекуле нет такой химической связи, на которую  может воздействовать каталитический центр данного фермента, то химических превращений этого вещества не произойдет. Занимая активный центр фермента, такие молекулы блокируют его  работу, т. е. являются обратимыми ингибиторами данного фермента (обратимыми, потому что связаны с ферментом слабыми  типами связей). Повышая концентрацию субстрата, их можно вытеснить из адсорбционного центра. Поэтому такие  ингибиторы называют конкурентными. Они  конкурируют с истинным субстратом данного фермента за обладание его  адсорбционным центром.

Аллостерическими центрами называют такие участки молекулы фермента вне его активного центра, которые способны связываться слабыми типами связей (значит - обратимо) с тем или иным веществом (лигандом). Причем такое связывание приводит к такой конформационной перестройке молекулы фермента, которая распространяется и на активный центр, облегчая, либо затрудняя (замедляя) его работу. Соответственно такие вещества называются аллостерическими активаторами или аллостерическими ингибаторами данного фермента.

Термин "аллостерический" (т. е. "имеющий иную пространственную структуру") появился в связи с тем, что эти эффекторы по своей пространственной конфигурации совсем не похожи на молекулу субстрата данного фермента (и потому не могут связываться с активным центром фермента). Было сделано заключение, что и аллостерический центр не похож по своей структуре на активный центр фермента.

Аллостерические центры найдены не у всех ферментов. Они есть у тех ферментов, работа которых может изменяться под действием гормонов, медиаторов и других биологически активных веществ. Некоторые искусственно синтезированные лекарства обладают биологической активностью потому, что их молекулы комплементарны аллостерическому центру некоторых ферментов организма.

 
КОФЕРМEНТЫ (от лат. со- - приставка, означающая совместность, и ферменты) (коэнзимы), орг. прир. соед., необходимые для осуществления каталитич. действия ферментов. Эти в-ва, в отличие от белкового компонента фермента (апофермента), имеют сравнительно небольшую мол. массу и, как правило, термостабильны. Иногда под коферментами подразумевают любые низкомол. в-ва, участие к-рых необходимо для проявления каталитич. действия фермента, в т. ч. и ионы, напр. К⁺, Mg²⁺ и Мn²⁺ . Располагаются коферменты в активном центре фермента и вместе с субстратом и функц. группами активного центра образуют активир. комплекс. Коферменты должны обладать по крайней мере двумя функциональными участками или группировками, ответственными за специфич. связывание с апоферментом и субстратом. Часто коферменты прочно связаны с апоферментом - образуют с ним трудно диссоциирующие или недиссоциирующие комплексы либо соединены с полипептидной цепью ковалентной связью (такие коферменты наз. простетич. группой). В этом случае коферменты обычно остаются в составе фермента на всех стадиях каталитич. р-ции. Примеры таких коферментов - флавиновые коферменты (см. Рибофлавин) и пиридоксаль-5'-фосфат (см. Витамин В₆). Легко диссоциирующие коферменты-обычно коферменты-переносчики, действие к-рых связано с переходом от одной молекулы фермента к другой. Нек-рые коферменты, напр. НАД (никотинамидадениндинуклеотид; см. Ниацин), в зависимости от каталитич. р-ций, в к-рых они участвуют, могут функционировать как простетич. группа или покидать активный центр фермента. Известны десятки орг. соед., выполняющих ф-ции коферментов. Эти в-ва, как правило, содержат системы сопряженных p-связей и (или) гетероатомы. Многие коферменты включают в качестве структурного компонента остаток молекулы витамина (т. наз. коферментные формы витаминов). Различают две группы коферментов. Относящиеся к первой группе коферменты участвуют в р-циях, в к-рых превращ. субстрата катализируется одним ферментом. При этом кофермент может регенерироваться после каждого каталитич. акта в составе фермента, катализирующего превращ. субстрата, или как косубстрат. В последнем случае регенерация кофермента осуществляется др. ферментом в сопряженной р-ции (в таких р-циях противопоставление кофермента и субстрата носит условный характер). Коферменты второй группы участвуют в активации и переносе молекул субстрата (или их частей) от одного фермента к другому. В этом случае первоначально субстрат реагирует с коферментом в активном центре фермента с образованием достаточно устойчивого соед., к-рое может в неизменном виде переноситься в клетке к др. ферменту, в активном центре к-рого осуществляются каталитич. превращ. субстрата и одноврем. регенерация кофермента. Образование комплекса апофермента с коферментом - один из способов регуляции активности фермента в организме (см. Регуляторы ферментов). Ниже рассмотрены важнейшие коферменты. Никотинамидные коферменты - коферментная форма витамина ниацина. К этой группе коферментов, универсальных по распространению (они найдены буквально во всех живых клетках) и биол. роли, относятся НАД (ф-ла I; R=Н) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат, или НАДФ [I; R=РО(ОН)₂], а также восстановленные (по пиридиновому кольцу) формы этих соед. (соотв. НАДН и НАДФН). наиб. важная биохим. ф-ция этих коферментов - их участие в переносе электронов и водорода от окисляющихся субстратов  
 
к кислороду в клеточном дыхании. При участии НАД или НАДФ, связанных прочно или легко диссоциирующих, ферменты дегидрогеназы (напр., алкогольдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа) катализируют обратимое превращ. спиртов, гидроксикислот и нек-рых аминокислот в соответствующие альдегиды, кетоны или кетокислоты. Флавиновые коферменты-коферментная форма витамина рибофлавина. Среди оксидоредуктаз дыхательной цепи, участвующих в переносе электронов и водорода, большое значение имеют флавопротеиды-ферменты, содержащие в качестве простетич. групп флавинмононуклеотид (ФМН; IIа) и флавинадениндинуклеотид (ФАД; IIб). В нек-рых ферментах (напр., в сукцинатдегидрогеназе) ковалентная связь ФАД с апоферментом образована пирофосфатной группой кофермента и атомом N имадазольного кольца гистидина. Восстановление флавиновых коферментов осуществляется через ряд промежут. стадий, включающих образование радикалов.  
 
Главная ф-ция флавиновых коферментов-перенос электронов (водорода) в окислит.-восстановит. цепи от НАДН и янтарной к-ты к цитохромам. Флавопротеиды катализируют также многочисл. р-ции, механизм к-рых включает стадию одноэлектронного переноса; окисление восстановл. формы амида липоевой к-ты, синтез кобамидного кофермента из АТФ и витамина В₁₂, окисление глюкозы и др. Глутатион (III)-коферменты нек-рых ферментов, катализирующих превращение a-диальдегидов в a-гидроксикислоты, изомеризацию производных малеиновой к-ты в производные фумаровой к-ты (малеинат - циc-транс-изомераза) и енолизацию ароматич. a-кетокислот (фенилпируваттаутомераза).  
 
Коферменты, содержащие порфириновыи макроцикл. Эти коферменты в составе нек-рых ферментов (напр., цитохромы а, б и с, цитохром-с-оксидазы) участвуют в клеточном дыхании. Аденозинтрифосфорная кислота (см. Аденозинфосфорные кислоты) - кофермент ферментов, катализирующих перенос гл. обр. фосфатных и пирофосфатных групп (напр., фосфотрансфераз) на разл. субстраты у всех живых организмов. Известны также случаи переноса 5'-дезоксиаденозильного остатка от АТФ с отщеплением трифосфата. Кофермент А (КоASH, КоА; IV) - коферментная форма витамина пантотеновой кислоты. Ферменты, содержащие этот кофермент, катализируют р-ции, играющие важную роль в цикле трикарбоновых к-т. Этот цикл начинается с биосинтеза ацетилкофермента A [KoASC(O)CH₃] в результате переноса ацетильной группы на KoASH с пировиноградной к-ты (фермент - пируватдегидрогеназа), а затем образования лимонной к-ты путем переноса ацетильной группы с  
 
KoASC(O)CH₃ на ацетилщавелевую к-ту (фермент-цитрат-синтаза). Кофермент А - также кофермент ферментов, участвующих в глиоксилатном цикле, окислении и синтезе жирных к-т, биосинтезе стероидов, каротиноидов, изопреноидов, нейтральных липидов и др. Во всех случаях KoASH действует как промежут. акцептор и переносчик разл. кислотных остатков, к-рые подвергаются в составе ацил - КоА тем или иным превращениям или передаются в неизменном виде на определенные метаболиты. Во всех случаях KoASH связан с ацильными остатками тиоэфирной связью. Тетрагидрофолиевая кислота (FH₄; V) - коферментная форма витамина фолацина. Является коферментом ферментов, катализирующих перенос одноуглеродных групп [СН₃, СН₂, СН, СНО, СН(=NH)] в биосинтезе пуринов, пиримидинов и нек-рых аминокислот. FH₄ - кофермент ключевых ферментов в биосинтезе гетероцикла тимидина (напр., тимидилатсинтетазы) - структурного фрагмента молекул ДНК.  
 
Пиридоксаль-5'-фосфат (VI) коферментная форма витамина В₆. Входит в состав мн. ферментов, катализирующих превращения a-аминокислот, в т. ч. их рацемизацию, переами-нирование, декарбоксилирование, элиминирование или замещение у b- и g-атомов углерода. Осн. стадия в механизме этих р-ций образование основания Шиффа в результате взаимод. a-аминогруппы  
 
к-ты и карбонильной группы кофермента (см., напр., Аспартатаминотрансфераза, Изомeразы). Тиаминдифосфат (тиаминпирофосфат, кокарбоксилаза, ТДФ; VII) - коферментная форма витамина тиамина. Коферменты мн. ферментов, катализирующих превращения a-кетокислот  
 
и кетоз, в т. ч. декарбоксилирование (фермент пируватдекарбоксилаза) и окислит. декарбоксилирование пировиноградной к-ты (в последнем случае с участием липоевой к-ты), при образовании и расщеплении a-гидроксикетонов и дикетонов под влиянием фосфо- и транскетолаз. Реакц. центр ТДФ - атом С в положении 2 тиазолиевого кольца (обозначен звездочкой), к-рый легко образует карбанион в результате элиминирования Н⁺. Механизм каталитич. р-ции обычно включает образование ковалентной связи в результате взаимод. субстрата (или его фрагмента) с этим карбанионом. Биотин (VIII) - кофермент ферментов, катализирующих перенос группы СО₂ в обратимых р-циях карбоксилирования. Молекула биотина связана с апоферментом пептидной связью, образованной его карбоксильной группой и e-аминогруппой лизина в апоферменте (биотиниллизиновый остаток наз. биоцитином). Переносимая группа СО₂ обратимо связывается с атомом в положении 1' биотина. Один из важных ферментов, в к-ром биотин выполняет ф-ции кофермента, - пируваткарбоксилаза.  
 
Она катализирует АТФ - зависимую р-цию образования щавелевоуксусной к-ты из пировиноградной и HCO^-₃. Кобамидные коферменты (кобаламиновые коферменты, ф-лы см. в ст. Витамин В₁₂). К этой группе относятся два кофермента - метилкобаламин и 5' - дезоксиаденозилкобаламин. Первый участвует в составе ферментов, катализирующих перенос групп СН₃, напр. при синтезе метионина из гомоцистеина. Биол. роль второго кофермента состоит в участии в составе ферментов в каталитич. превращениях диолов в альдегиды (пропандиолдегидратаза), алканоламинов в альдегиды (этаноламин - аммиак-лиаза) и рибонуклеотидов в дезоксирибонуклeотиды (рибонуклеотидредуктаза), метилмалонил-кофермент А в сукцинил-кофермент А (метилмалонил-СоА-мутаза). Важная особенность этих коферментов-гомолиз связи Со—С в каталитич. р-циях. Нек-рые коферменты, напр. аденозинтрифосфорная к-та, 5'-дезок-сиаденозилкобаламин (кобамамид), тиаминдифосфат (кокарбоксилаза), флавинадениндинуклеотид (флавинат), применяют как лек. ср-ва; многие коферменты-лиганды в аффинной хроматографии.