Анықтамалар, қысқартулар мен белгілеулер

     6-шы кесте мәліметтері бойынша 1Д7А2, 2С10FЗ және 1G3Н2 гибридом штаммдарының моноклоналды антиденелерінің Мусоbacterium tuberculosis жасушаларымен 1:102400-1:104800 титрде әрекеттесе, Мусоbacterium bovis жасушаларымен 1:400-1:800 титр аралығында ғана байланысқа түсіп отыр. Ал Мусоbacterium avium, іпtracellulare, scrofulaceum,, каnsassii, fortuitum және рhlеі түрлерімен әрекеттеспейтіндігі анықталды.

     Басқа микобактериалды антигендерге  қатысты МКА телімділігін талдауда 1Д7А2, 2С10F3 және 1G3Н2 гибридома штаммдары синтездейтін моноклоналды антиденелер Мусоbасterium bovis шт. 8. тұтас жасушасы компоненттерінің кұрамынан туыстас эпитоптар аныкталды. Мусоbacterium аvіит мен атипті микобактериялардың (М. рhіеі, М. scrofulaceum) тұтас жасушалары құрамында зерттелетін штаммдардың МКА танитын эпитоптары жоқ екендігін айта кеткен жөн. Бұл М. tuberculosis-тің тұтас жасушасына тән эпитоптарға моноклоналды антиденелердің барлықтарының да телімділігінің жоғары екендігін дәлелдейді.

     Моноклоналды антиденелердің класын  анықтау тышкандардың иммуноглобулиндеріне ІgМ, ІgА, IgG, ІgG2, ІgG2b (Sigma, США) қарсы монотелімді қан сарысуларын қолдану аркылы диффузиялык преципитация реакциясында (ДПР) жүзеге асырылды.

     Аталмыш тәсілді жүргізу барысында монотелімді қан сарысуы мен МКА үлгілері бар шұңқыршыктарының араларында анык преципитация сызығы пайда болғанын көреміз. Қорыта келе моноклоналды антиденелердің барлық үш түрі де IgG1 класына жататындығын дәлелдеп берді.

     Аффинділік байланыс константын анықтау көмегімен сандык түрде өлшенуі мүмкін. 1Д7А2 жэне 2С10FЗ штаммдарының моноклоналды антиденелерінің өз антигендерімен байланысу константасы сәйкесінше 1х10‾⁸М және 1х10^_9М болады. Ал 1G2Н2 штамының моноклоналды антиденелері жоғарыда көрсетілген антиденелермен салыстырғанда төмен аффинділікке ие болды. Алынған МКА түрлерінің иммундыхимиялык сипаттамасын зерттеу бойынша алынған мәліметтер 7-ші кестеде көрсетілген. 

Кесте 7 - Гибридом штаммдары МКА иммундыхимиялык касиеттері

     Иммуноглобулинді препараттарының тазалығын зерттеу мақсатында аммоний сульфатымен тазартылған МКА 0,1% натрий додецилсульфаты бар 10% полиакриламидті гельдегі электрофорез әдісімен талданды.

     Электрофорез нәтижесінде МКА барлык түрлері молекулалык салмақтары 60 кДа жэне 20 кДа болатын екі ақуызды фракцияға бөлінді, бұл иммуноглобулиндердің ауыр және жеңіл тізбектеріне сәйкес келеді. Электрофореграммада баска жолақтар байқалмады, бұл зерттелген моноклоналды антиденелердің тазалығын көрсетеді.

     Сонымен, 1Д7А2, 2С10FЗ және 1G3H2 штамдарының түзегін МКА мен иммундыхимиялык қасиеттері жағынан антигендерге койылатын талаптарға сәйкес келеді және оларды жұкпалы ауруларды, соның ішінде туберкулез балауына арналған иммунды ферменттік тест-жүйесін әзірлеуге қажетті негізгі препарат ретінде пайдалануға болады [6]. 

2.2.3 Адам туберкулезінің серологиялық балауында моноклоналды антиденелерді колдана отырып ИФТ және ИФР әдістерін кою 

     Осы зерттеудің максаты адамдар  қан сарысуындағы туберкулезге  қарсы антиденелерді анықтау  үшін ИФТ «жанама» және «бәсекелі»  қойылымдарын ИФР-ын жүргізу шарттары мен техникасын жетілдіру болып табылады. Осыған байланысгы біз Мусоbacterium tuberculosis-тың ақуызды антигеніне антиденені табу үшін ИФТ-дың сезімталдығына физико-химиялык факторлардың (температура, иондык күш және реакциялык ортаның рН маңызы, өзара байланысу ұзактығы, концентрациялық катынасы) әсерін зерттедік.

     Туберкулез микобактерияларына телімді антиденелерді ИФТ «жанама» қойылымымен анықтау сызбасы негізгі 5 кезеңнен тұрады:

1. – ші кезеңде -антиген катты фазага адсорбцияланады.

     2 – ші кезеңде - зерттеуге алынған  материал кұрамындағы антиденелер  катты фазаға адсорбцияланған антигенмен спецификалық байланысады да «антиген+антидене» иммунды кешенін кұрайды.

     3-ші кезең - ферментпен танбаланған антиденелер (конъюгат) «антиген+ антидене» кешенімен телімді байланысып, «антиген+антидене+конъюгат» иммунды кешеніні пайда болады.

     4-ші кезең - субстрат ерітіндісінің көмегімен «антиген+антидене+ конъюгат» иммунды кешенін анықтау. Бұл кезенде, реакция нәтижесі оң болған жағдайда субстрат сұйықтығының түсінің өзгеруі байқалады.

     5-ші кезең - реакция нәтижесін немесе ферменттік реакция өнімдерінің оптикалық тығыздығын спектрофотометрдің көмегі арқылы бағалау.

     ИФТ-дың «бәсекелі» койылымында антиген қатты фазаға адсорбцияланған моноклоналды антиденелермен байланысып реакция кезеңі бір сатыға артады.

     Әрбір кезеңнің оңтайлы параметрлерін анықтау үшін ИФТ-ды бес рет қайталап жүргіздік.

     Зерттеу нәтижелері бойынша ИФТ-дың жеткілікті сезімталдығын камтамасыз ететін Мусоbacterium tuberculosis-тің ақуызды антигенінің оңтайлы концентрациясы 5-10 мкг/мл-ді көрсетті. Антигендердің концентрациясын әрі қарай жоғарылату реакцияның телімсіз боялуының артуы мен препараттарды ұтымсыз жұмсауға алып келді. Алынған нәтижелерді талдау барысында колданылған барлық ақуызды антигендердің ИФТ-ға қажетті қатты фазада жақсы сорбцияланатындыгын дәлелдейді.

     Біз иммунды ферментті талдауда бірінші антидене мен антиген ретінде қолданылатын Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ақуызды антигеніне телімді моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау үшін бірқатар тәжірибе жүргіздік. Моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау барысында моноклоналды антиденелердің концентрациясы 10 мкг/мл болған жағдайда полистиролды планшет шұңқыршықтарының белсенді орталыктарының толық инактивацияланатындығы айкындалды. Моноклоналды антиденелердің анағұрлым жоғары концентрациясын колдану препараттарды орынсыз жұмсалуына әкеліп соқтырды. Моноклоналды антиденелерді катты фазамен толық байланыстыру үрдісі 37°С температурада 1 сағатта аяқталды. Сонымен катар, сенсибилизацияны 4°С температурада 16 сағат бойы жүргізген жағдайда да жаксы нәтижелерге кол жеткіздік. Түрлі буферлі ерітінділердің рН-ның мәнін МКА қатты фаза беткейінде адсорбциялануына, «МКА+антиген+телімді антидене+конъюгат» кешенінің пайда болу реакциясына әсері түрлі иондық күш (2,0-ден 10,0-ға дейінгі) диапазоны зерттелінді. Буферлік жүйе ретінде зерттеуге рН 2.0 жэне 4,0 болатын натрий-ацетатты ерітіндісі, рН 7,0 және 7,4 болатын буферленген физиологиялық ерітінді, рН 9,5 және 10,0 болатын натрий-карбонатты буфері алынды. Тәжірибелер нәтижелері бойынша, ИФТ-да реакциялық сұйықтықтың боялу карқындылығы буферлі ерітінділердің рН мәніне тікелей тәуелді, яғни олардың рН-ы 7,0-10,0 аралығында болған жағдайда жоғары көрсеткіштерге қол жеткіздік. ИФТ қоюда антиген мен зерттелетін антидене арасындағы, сонымен қатар «антиген-антидене» иммунды кешені мен иммунды пероксидазалы конъюгат арасындағы тепе-тендік айтарлыкқтай маңызды орын алатындығы белгілі. Катты фаза беткейіне адсорбцияланған антиген мен МКА байланысу кинетикасын бағалау +37°С температурада 30 минут, 1, 2, 3 және 4 сағат аралығында жүрг ізілді.

     Антиген-антидене реакциясындағы  тепе-теңдік 2 сағат инкубацияланғаннан кейін пайда болып, оларды оптикалык тығыздығы 0,980- 1.044 о.б. кұрады. Экстинцияның жоғарылауы катты фаза беткейімен ақуыздың телімсіз байланысуының арқасында «фондық» көрсеткіштің 20-40% артуына алып келді.

     Түрге қарсы пероксидазалық конъюгат пен антиген+антидене кешенінін байланысын бағалау нәтижесінде жүйелер арасындағы тепе-теңдік +37^°С температурада 1 сағат бойы инкубациялау барысында байқалды. Ал, реакциялык сұйыктықтың оптикалық тығыздығы 0,930-0,950 о.б. шамасында ауытқып отырды. Негативті бақылау сарысуын қолданған жағдайда бұл көрсеткіш 0,370-0,390 о.б. шамасында болды. 1 сағаттан артық инкубациялау бақылауга койылған сынаманың оптикалық тығыздық шамасының 30-35%-ға артып «фондық» боялудың өсуіне алып келді.

     Біз антитүрлік конъюгаттардың (флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) «Сигма» шығарған (ФРГ) «антиген-антидене» кешенімен байланысу кинетикасына әсер ету ұзақтығы мен тәртібін зерттедік (8-кесте). 

Кесте 8 - ФИТЦ-пен МКА-ді конъюгациялау шарттары

     Кестеден көргеніміздей 1 мг МКА-де ФИТЦ-тің анағұрлым үйлесімді мөлшері 30-40 мкг кұрады. Экспозициянын жоғарылауы ФИТЦ бояғышы коспаларының болуына байланысты «фондық» көрсеткішінің 40-60%-ғы артатындығы байкалды.

     Иммунды флюоресцентті конъюгатты қолдану барысында телімсіз байланысудың (боялу) анағұрлым төмен дәрежесі мен флюоресценция максималды жұмыс сұйылтымы 1:50-ге жетті.

     Иммунды флюоресцентті реакциясының тікелей әдісін қажетті жағынды микобактериядан заттық шынысының бетінде дайындалды.

     Туберкулезге шалдыққан науқастардан алынған биологиялық материалдың барлығы 10 сынамасы «бэсекелі» ИФТ және ИФР әдістерімен зерттелді. Бакылау ретінде Циль-Нильсен әдісімен боялған жағындылар микроскопиясы мен тығыз қоректік орталарда өсірілген Мусоbacterium tuberculosis культурасы анықталды (9-кесте). 

Кесте 9 - Туберкулезге алынған сынамаларды зерттеу нәтижелері