Анықтамалар, қысқартулар мен белгілеулер

     Кесте мэліметтері бойынша иммунды флюоресцентті реакциясы мен иммунды ферментті талдаудың бәсекелесу түрі бактериоскопия мен бактериология нәтижелерімен сәйкес келетіндігі айқындалып отыр.

     Моноклоналды антиденелерді қолдана отыра жүргізілген ИФТ және ИФР әдістері адам туберкулезінің балауына кететін уакыттың едәуір қысқаруына мүмкіндік береді.

     Туберкулезге шалдыкқан адамдардын қан сарысуындағы туберкулезге қарсы антиденелерді анықтау

     Жұмыс барысында 120 туберкулезге шалдыққан адамдардың кан сарысуы және 80 дені сау адамдардың қан сарысуы зерттелді. Туберкулезге қарсы түзілген антиденелерді анықтау иммунды ферментті талдаудың бәсекелестік қойылымымен жүзеге асырдық. Бұл әдістің ерекшелігі мынада: қатты фазаға бекітілген антигенге моноклоналды антиденелер мен науқас адамдардың кан сарысуындағы телімді антиденелердің отыруына бәсекелесуінде.

     М. tuberculosis -тің ақуызды антигенінің концентрациясы 10 мкг/мл тең 96- шұнкыршықты полистирольді планшетіне 25 мкл отырғыздык. Антиген сенсибилизацияланбаған планшетгің бос аймактарын 1%-ды сиыр сарысуы альбуминімен бекіттік. Туберкулезге шалдыққан адамдардың қан сарысуын және дені сау (донорлардың) адамдардың қан сарысуларын БСА, ФТЕ-Т ертіндісінде 1:5, 1:25 және 1:125 мөлшерде сұйылтып, моноклоналды антиденелердің глобулинді фракциясымен (10 мкг/мл) бірдей деңгейде араластырдық. Содан кейін осы сұйықтықты үш қатардан планшетке отырғызып 4°С-де 12 сағ. инкубацияладық. Бақылау ретінде концентрациясы 5 мкг/мл моноклоналды антидене + планшетке отырғызылған антигеннің тікелей байланысу реакциясы колданылды. Конъюгат ретінде тышканның иммуноглобулинімен адам иммуноглобулиніне қарсы алынған және пероксидазамен таңбаланған коянның антиденелері қолданылды. Хромогенді субстрат ретінде ортофенилендиамин пайдаланылды. Реакцияны 1,25 М Н28О4 ерітіндісі көмегімен токтаттық. Талдау нәтижесін толқын ұзындығы 492 нм болатын вертикалды жарық ағыны бар спектрофотометр (Dynateck, Германия) көмегімен шығардық. Қан сарысуы кұрамындағы антиденелердің болуын тікелей реакция нәтижесімен салыстыра отыра (%), яғни моноклоналды антиденелер және антигенге байланысты тұжырымдадық. Егер реакция интенсивтілігі бақылаудағы тікелей реакция сынамадан 50% төмен болса, онда сынама нәтижесін он деп санаймыз.

     Сау адамдар мен туберкулезге шалдыққан адамдардың кан сарысуындағы туберкулезге карсы антиденелерді анықтаудың бәсекелестік талдауы 10-шы кестеде көрсетілген. 

Кесте 10 - М tuberculosis-тің ақуызды антигенімен МКА мен адамның қан сарысуының ингибициясы бойынша тәжірибе реакциясын нәтижесінің мысалы

     Тікелей реакциядағы трипликат тығыздығының орташа көрсеткішін (100%) деп қабылдап, содан кейін трипликаттардың орташа көрсеткіштеріне сүйеніп тәжірибенін пайыздык байланысуын санап шығардык, ал тікелей реакция мен тәжірибе реакциясының айырмашылықтарын ингибиция нәтижесі ретінде қабылдадық.

     Статистикалык өндеуді Стьюдент өлшемі бойынша жүргіздік (1:25 сұйылтымында алынған қан сарысуы нәтижелерін колдандык, 11-кесте). 

Кесте 11 — М.tuberculosis-тің ақуызды антигенімен МКА туберкулезге қарсы антиденемен ингибиция көрсеткіші

     Кестеде көрсетілгендей, туберкулезге шалдыққан адамдар мен сау адамдардың ингибициясының пайыздык айырмашылығы статистикалық айқындалды.

     Пайыздық ингибицияның көрсеткіші 50%-ға жетсе немесе одан жоғары  болған жағдайда тәжірибенің нәтижесін оң деп санадық (ауру адамдар мен сау адамдардың айқын айырмашылыгының көрсеткіштері 50%, сондай ақ тікелей реакция ингибициясының көрсеткіші одан аса түсті).

     120 туберкулезге шалдыққан адамның ішінен 74 наукастың қан сарысуы сұйылтымының 1:5 және 1:25 болғанда және 80 сау донордын ішінен 4 адам он нәтиже (МКА мен ингибициясы) көрсетті. Ауру адамдардың кан сарысулары және сау адамдардын қан сарысулары 1:125 сұйылтымында әдеттегідей нәтиже 0-35% тура реакция ингибициясын берді.

     Сонымен, алынған нәтижелер сау адамдар мен туберкулезге шалдыққан адамдардың зерттеліп отырған моноклоналды антиденелер бағытталған, салмағы 20,8 кДа антигендік детерминантасына елеулі айырмашылықтары бар екенін дәлелдейді. Туберкулезге шалдыққан адамдардың оң нәтижелі реакциялардың аз көлемі әдеттегідей жағдай, өйткені адамдарда ауру тудыратын адамдық вирулентті микобактерилерінде, сөзсіз, баска да эмбебап антигендік детерминанталары болады.

     Сау адамдар реакциясының оң нәтиже беруін халык арасында инфицирленген адамдардың болуымен және ұксас антигендік детерминанттар БЦЖ микобактериінде болуымен түсіндіріледі.

     Моноклоналды антиденелер негізінде ИФТ «жанама» тәсілін ИФТ-ың «бәсекелі» тәсілімен салыстырмалы талдауы өткізілді (12-кесте).

Кесте 12 - МКА негізінде  «бәсекелі» ИФТ-дың  диагностикалық кұндылығын анықтау нәтижесі

     12-ші кестеде көрсетілген, туберкулезді зерттеуде бір уакытта ИФТ екі әдіспен («жанама» ИФТ және «бәсекелі» ИФТ) және бактериологиялық зерттеулерде 120 оң және 80 теріс сынама жасалынды. 120 сынаманың ішінен «бәсекелі» ИФТ-да 74-і оң (78,3%), ал «жанама» ИФТ-да 87-і он (72,5%) нәтиже көрсетті. 80 теріс сынаманын ішінде «бәсекелі» ИФТ-да 4-і (5%), ал «жанама» ИФТ-да 15-і (12,5%) оң нәтиже көрсетті.

     120 он үлгілерде «бәсекелі» ИФТ-дың бактериология әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 100% тен болды, ал ИФТ-дың бактериоскопия әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 94,5% құрады. Ал «жанама» ИФТ мен бактериологияның нәтижелерінің бірдей болу пайызы 85%, ал бактериоскопиямен 80%.

     Зерттеу нәтижелері «бәсекелі»  ИФТ әдістің телімділігі «жанама» ИФТ-ға карағанда жоғары екенін көрсетті.

     Сонымен алынған моноклоналды антиденелер адам туберкулездің серологиялык балауында колдануға жарамды болып табылды. Осы антиденелер көмегімен қан сарысу кұрамындағы туберкулезге карсы антиденелерді ИФТ- дың «бәсекелі» қойылымымен толығырак анықтауға мүмкіндік береді [8].

ҚОРЫТЫНДЫ 

     Атқарыған зерттеу жұмыстарының  нәтижесінде Мусоbacterium tuberculosis-тің ақуызды антигеніне телімді моноклоналды антиденелердің негізінде әзірленген иммунды ферменттік талдаудың бәсекелі нұсқасымен адам туберкулезін тез арада анықтау балауында косымша әдіс ретінде колдануға болатындығы анықталды.

     Курстық жұмыстың алынған нәтижелері бойынша мынадай қорытындылар шығарылды:

1. О. Westphal бойынша сулы-фенолды әдісімен және ультрадыбысты дезинтеграция арқылы зерттеуге арналған микобактериялардың липополисахаридті және ақуызды антигендері алынды. ЛПС шығуы микроорганизм түріне және колданылған микробтың салмағына тәуелді 2,2-3,5 мг немесе 0,018-0,0088%-ды кұрады, сонымен катар ақуызды антиген 31,25-62,5 мг немесе 0,125-0,32% мөлшерде алынды.
2. Иммундеудің екі апталык сызбасын колдана отыра егілген ВАLВ/с тышқандарының ағзаларында микобактерия антигендеріне телімді моноклоналды антиденелер қаркынды синтезделіп олардын ИФТ «жанама» койылымындағы титрлері 1:12800-1:25600-ге жетті.
3. Гибридомдық технология әдісімен 3 штам алынды. 1Д7А2, 2С10F3 және 1G3H2 моноклоналды антиделерді тұрақты синтездейтін гибридоманын ІgG1 класс тармағына жататын және байланысу константасы 1 х 10-⁷ М-дан 1 х 10 -⁹ М-га тең болғандығы анықталды.
4. Гибридома штамдарын синтездік тышкандардың кұрсақ қуысында өсіру барысында алынған асцит сұйыктығындағы МКА мөлшері 4-8 мг/мл кұрады. ИФТ моноклоналды антиденелер титрі өсінді салыстырғанда 800-1600 есеге жоғарылады. Гибридома штамдарының моноклоналды антиденелері ИФТ М. tuberculosis-ке телімділігімен сипатталды, ягни М аviит тұтас жасушаларымен және М. рhlеі, М. scrofulaceum атипиялык микобактериялардың тұтас жасушаларымен байланыспайды.
5. Бәсекелі ИФТ қойылымында 120 туберкулезге шалдықкан адамның ішінен 74 науқастың қан сарысуы сұйылтымының 1:5 және 1:25 болғанда және 80 сау донордың ішінен 4 адам оң нәтиже (МКА мен ингибициясы) көрсетті.
6. 120 он үлгілерде «бәсекелі» ИФТ-дың бактериология әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 100% тең болды, ал ИФТ-дың бактериоскопия әдісімен нәтижелердің сәйкес келуі 94,5% кұрады. Ал «жанама» ИФТ мен бактериологияның нәтижелерінің бірдей болу пайызы 85%, ал бактериоскопиямен 80%.

     Жұмыста койылган міндеттер толықтай орындалды. Моноклоналды антиденелер негізіндегі ИФТ-дың бәсекелесу нұскасын ғылыми-зерттеу зертханаларында және медициналык мекемелерде адам туберкулезін балауға арналған қосымша серологиялық әдіс ретінде колдануға ұсынылады.