Генетическая инженерия

     Генетическая  инженерия

     Одним из разделов молекулярной генетики и  молекулярной биологии, который нашел  наибольшее практическое приложение, является генная инженерия.

     Генная  инженерия - это сумма методов, позволяющих  переносить гены из одного организма  в другой, или - это технология направленного  конструирования новых биологических  объектов.

Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих  в «фабрики» для масштабного  производства любого белка.

Это дает возможность детально анализировать  структуру и функции белков и  использовать их в качестве лекарственных  средств.

     История генетической инженерии

     Генная  инженерия появилась благодаря  работам многих исследователей в  разных отраслях биохимии и молекулярной генетики.

На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу.

Лишь  в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК.

С этого  времени начинается интенсивное  изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность  была подтверждена экспериментально.

Шло интенсивное  развитие молекулярной генетики, объектами  которой стали кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды.

Были  разработаны методы выделения высокоочищенных  препаратов неповрежденных молекул  ДНК, плазмид и вирусов.

ДНК вирусов  и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов.

В 70-х  годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения  ДНК. Особая роль в развитии методов  генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно  условно разделить на три этапа:

Первый  этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй  этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий  этап - начало работ по включению  в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные  встраиваться в генетический аппарат  клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии  следует считать 1972 год, когда в  Стенфордском университете П. Берг и С. Коэн с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

     Цель  прикладной генетической инженерии  заключается в конструировании  таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания. Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, передающие мутантный ген потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.

Технология  рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

· специфическое  расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

· быстрое  секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

· конструирование  рекомбинантной ДНК;

· гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая  выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью  и чувствительностью;

· клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

· введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

     Одно  из основных применений техники клонирования-выделение индивидуальных генов непосредственно из генетического материала. Каждый индивидуальный ген представляет собой только очень небольшую часть эукариотического генома. Например, размер генома типичной клетки млекопитающих составляет около 109 п.н., так что один ген размером, скажем, 5000 п. н. составляет только 0,00005% всей ядерной ДНК. Для идентификации столь незначительного количества материала необходимо иметь высокоспецифичный зонд, взаимодействующий только с определенными, интересующими исследователя последовательностями, чтобы выделить их из огромного количества других последовательностей. Обычно применяемый метод состоит в использовании высокомеченых радиоактивных РНК- или ДНК-зондов, гибридизация которых с геном регистрируется с помощью радиоавтографии. 
Возникающее при этом затруднение связано с получением мРНК, соответствующей специфическому белку. Оно может оказаться крайне трудным, когда белковый продукт присутствует в клетке в незначительном количестве. Существует несколько методов выделения мРНК, основанных на использовании свойств ее продукта, в том числе чувствительный метод обнаружения продуктов синтеза после инъекции РНК в ооциты ксенопуса. Эффективный метод выделения ДНК, комплементарной мРНК,-трансляция, подавляемая гибридом; в основе метода лежит способность кДНК подавлять трансляцию мРНК, гибридизуясь с ней, в результате чего продукт реакции исчезает из системы трансляции in vitro. 
Ранее сама мРНК использовалась в качестве зонда для выделения генов. Этот метод имел ряд практических недостатков. мРНК никогда не бывает абсолютно чистой, и ее трудно получить в достаточном количестве. Действительно, метод хорошо подходит для выделения генов, мРНК которых представлены большим числом копий, но не может быть использован в случае слабо экс-прессирующихся генов. Другая трудность состоит в том, что часто не удается получить мРНК с достаточно высокой радиоактивной меткой. 
Поэтому вместо мРНК в качестве зонда стали использовать клонированную кДНК-копию мРНК. С помощью уже описанных ранее методов могут быть получены большие количества очищенного материала. Этот материал может быть помечен in vitro с получением очень высокой специфической радиоактивности. 
Первый шаг при идентификации гена, соответствующего специфическому зонду, состоит в дроблении ДНК генома на фрагменты удобного для работы размера. Желательно, чтобы ген находился в как можно меньшем количестве фрагментов (в идеальном случае-только в одном). Обычно максимальная длина фрагментов генома, с которыми можно работать, находится в пределах 15-20 т. п. н. Иногда оказывается невозможным получить ген в виде одного фрагмента, и тогда для определения его структуры необходимо собрать вместе данные, полученные при анализе его разных фрагментов. 
Для фрагментирования генома могут быть использованы два метода. Один из них-расщепление рестриктаза-ми. При этом каждый фрагмент заканчивается сайтом узнавания специфической рестриктазы. Другой метод состоит в механическом дроблении ДНК путем внесения в нее разрывов с частотой, определяемой условиями фрагментирования. В этом случае места разрывов располагаются совершенно случайно.

      Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК,

химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.

   Выделение генов из ДНК проводят  с помощью рестриктаз, катализи-

рующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклео-

тидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно

проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом

обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты

ДНК имеют  так называемые «тупые» концы. Возможно расщепление ДНК

со сдвигом, при этом одна из нитей выступает  на несколько нуклеотидов.

Образуемые  при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности

вступают  во взаимодействие.

   Нуклеотидную последовательность  с липкими концами можно присое-

динить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой),

превратить  в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно ком-

плиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как

достаточно  трудно подобрать действие ферментов  для строгого вычлене-

ния нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды

или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая  его в функцио-

нально неполноценный.

   Химико-ферментный синтез применяют  в том случае, если известна

первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген.

Необходимо  полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот

метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеоти-

дов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных

последовательностей и пр. Метод состоит из химического  синтеза одно-

цепочечных  фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного об-

разования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В

настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем

микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие

последовательности  одноцепочечной ДНК. На рис. 4.2 показана схема

такой машины, сконструированной канадской  фирмой «Био лоджикэлс».

Нужная  последовательность оснований вводится на клавишный пульт

управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помо-

щью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нук-

леотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка напол-

нена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В дан-

ном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со ско-

ростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помо-

щью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечно-

го нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-

цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.

  Конструирование рекомбинантных ДНК

  Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д.

  Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

  Сшивка  по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод)

  Этот  метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Некоторые  рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку" (рис. 36). Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов.