Генетическая инженерия

  Однако  после такого спаривания полной целостности  двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва  в фосфодиэфирном остове. Для его  восстановления, то есть сшивания, или  лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

  Сшивка  по "тупым" концам (коннекторный метод)

  Липкие  концы не абсолютно необходимы для  связывания фрагментов ДНК. Тупые концы  также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 40). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

  Поскольку можно формировать достаточно длинные  взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно ис¬пользуют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.

  Сшивка  фрагментов с разноименными липкими  концами 

  В ситуации, когда необходимо сшить  фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

  Существуют  большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании  линкеров должна учитываться необходимость  соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера  помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают  их экспрессию. Существуют линкеры "тупой  конец - липкий конец".

  При необходимости липкие концы можно  превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить.

  Медицинские биотехнологии подразделяются на диагностические и лечебные.

Диагностические медицинские биотехнологии подразделяются на химические (определение диагностических веществ и параметров их обмена) и физические (определение физических полей организма).

Определение физических полей человеческого  организма имеет большое диагностическое  значение. Физическая диагностика дешевле  и быстрее, чем химическая, поэтому  ее роль в будущем будет возрастать.

Раньше  диагностические химические биотехнологии  сводились к определению в  тканях и биологических жидкостях  веществ, имеющих диагностическое  значение. Назовем этот подход статическим. В настоящее время диагностика использует определение скоростей образования и распада представляющих интерес веществ, а также определение активности ферментов, осуществляющих соответственно синтез и деградацию этих веществ. Назовем этот подход динамическим. И, наконец диагностика стала оценивать влияние на метаболизм диагностических веществ определенных функциональных воздействий. Такой подход можно назвать функциональным. Он позволяет выявить резервные возможности организма.

В древности  для лечения больных использовали растения и минералы. В последние  два столетия широкое раcпространение получили синтетические химические препараты и антибиотики.

Сравнительно  недавно в фармакологии начали использовать индивидуальные биологически активные соединения и составлять их оптимальные  композиции, а также использовать специфические активаторы и ингибиторы определенных ферментов. Альтернативой  антибиотикам становится вытеснение патогенной микрофлоры сапрофитной микрофлорой (использование микробного антагонизма).

Кроме лекарственных методов лечения  в современной медицине используют еще ароматы (аромотерапия), механические воздействия (массаж) и воздействие физических полей (физиотерапия). Физические поля интересны тем, что с их помощью можно лечить самые разные заболевания. Наибольший интерес сейчас вызывают тепловое воздействие, лазерное излучение и КВЧ-излучение (электромагнитное излучение миллиметрового диапазона)

Наиболее  актуальными проблемами современной  медицины являются борьба с сердечно-сосудистыми заболеваниями (прежде всего с атеросклерозом), с онкологическими заболеваниями, с аллергиями, старением и с вирусными инфекциями (в том числе со СПИДом).

В последнее  время появились эффективные  средства борьбы с атеросклерозом. Это, прежде всего статины (и появляются все новые и более эффективные средства этого ряда). Считается, что широкое применение этих лекарств должно привести к существенному продлению жизни.

По мнению ряда специалистов, решение проблемы онкологических заболеваний будет  достигнуто с помощью иммунологических методов, позволяющих избирательно уничтожать опухолевые клетки. Решение  проблемы рака должно повысить среднюю  продолжительность жизни.

Решение проблем аллергических заболеваний  определяется развитием иммунологии  и прогрессом в изучении такой  фундаментальной проблемы медицины, как воспаление. Человечество еще очень плохо справляется вообще с вирусными инфекциями, а не только со СПИДом. Химиотерапия и антибиотики, позволяющие эффективно бороться с бактериальной инфекцией, не эффективны в отношении вирусов. Предполагается, что существенный прогресс в деле борьбы с вирусными инфекциями будет достигнут за счет развития молекулярной биологии вирусов, в частности изучения взаимодействия вирусов со специфическими для них клеточными рецепторами.

Расшифровка генома человека и успехи в клонировании животных открывают ошеломляющие перспективы в медицине. Однако здесь не все так просто. Мало знать структуру конкретного гена, надо еще знать, как регулируется его активность. Интенсивные работы в области регуляции активности генома эукариот в сочетании с совершенствованием методов генной инженерии должны обеспечить решающий прогресс в лечении таких заболеваний, как диабет. Использование метода клонирования человека может привести к созданию банка "запасных частей" для конкретных людей и обеспечить весьма значительное продление их жизни. Однако против этого выдвигаются возражения морального порядка. Представляется, что дилемма будет разрешена с созданием технологий клонирования тканей и органов.

Еще одну революцию в медицине вызывает изучение так называемых стволовых клеток, т.е. клеток, которые являются предшественниками других типов клеток, включая нервные.

Понятие о стволовых клетках впервые  появилось в России еще в начале прошлого века. Гистолог А.Н. Максимов изучая процесс кроветворения, пришел к выводу о их существовании.

Стволовые клетки могут давать начало любым  клеткам организма - и кожным, и  нервным, и клеткам крови.

Стволовые клетки можно выделять и растить  в культуре ткани. Способность давать множество разнообразных клеточных  типов делает стволовые клетки важнейшим  восстановительным резервом в организме, который используется для замещения  дефектов, возникающих в силу тех  или иных обстоятельств.

Стволовые клетки способны превращаться в клетки всех типов тканей: клетки крови, внутренних органов, мышечных и костных тканей, кожного покрова, нейроны и др. На ранних стадиях своего развития организм человека практически полностью  состоит из стволовых клеток, которые  постепенно приобретают специализацию, то есть из них образуются органы и  ткани организма. Таким образом, стволовые клетки являются, во-первых, своего рода строительным материалом организма. Также они принимают  непосредственное участие в регенеративных процессах организма и могут  замедлять процесс старения. Из-за способности к преобразованию в  клетки любых органов и тканей стволовые клетки играют роль «скорой  помощи»: если где-то в организме  неполадка, стволовые клетки направляются туда и заменяют потерянные в результате болезни или повреждения клетки органа, восстановливают его функции. С возрастом количество стволовых клеток уменьшается, и регенеративные возможности организма снижаются.

Использование стволовых клеток - это в перспективе  решение проблемы регенерации, т.е. радикального лечения инсульта, инфаркта, восстановления утраченных конечностей  и т.п., а также весьма существенное продление жизни.

Представляется, что сейчас лидерами медицинской  науки являются медицинская генетика и иммунология. Если биотехнология 20 века оперировала с отдельными генами и белками, то биотехнология  нынешнего столетия - это интеграция генов и белков. К сегодняшнему дню накоплено достаточно много  информации о генах и способах их регуляции, изменении их экспрессии при патологических процессах. Разработаны  принципиально новые подходы  к анализу изменения экспрессии генов при болезнях, что позволяет  быстро открывать новые гены, вовлеченные  в такие сложные патологии, как  рак, диабет и сердечно-сосудистые болезни. Благодаря развитию геномики появились новые возможности выбора конкретных мишеней для действия фармакологических средств.

Особое  место занимают системы диагностики, основанные на анализе изменений  в экспрессии генов при заболевании, что уже начинают использовать при  анализе инфекций, в судебной медицине и др. Выявление механизмов взаимодействия геномов множества патогенов с клетками-хозяевами открывает перспективы создания вакцин нового поколения.

Медицинская генетика может не только предотвращать  появление на свет генетически неполноценных  детей путем генетического консультирования их родителей и диагностировать  генетические заболевания. Ее перспектива-это  пересадка генов и управление их активностью.

Иммунология позволяет создавать новые подходы  к лечению иммунологических заболеваний (в том числе иммунодефицитов, аутоиммуннных заболеваний и аллергии), инфекционных и онкологических заболеваний.

Факт  лидерства генетики подтверждается и тем, что Нобелевская премия за 2007 год в номинации «Медицина  и физиология» присуждена «за  исследования основ введения специфических  генетических модификаций в организмы  мышей путем использования эмбриональных  стволовых клеток». Эта технология получила название нацеленного воздействия  на гены (gene targeting). Сегодня она широко используется для «выключения» (isolated), или, как еще говорят, «нокаута», определенного гена. Таким способом можно узнать, какова функция данного гена. Ее разделили между собой американцы Марио Капекки (Гарвардский университет, США), Оливер Смитис (Университет Северной Каролины, США) и британец сэр Мартин Эванс (Кардиффский университет, Великобритания).

1. НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ  В БИОФАРМАЦЕВТИКЕ

Сегодня человечество совершенно справедливо  полагает, что биотехнологические науки занимают приоритет в области современных высоких технологий. Сиквенирование геномов и валидация новых мишеней для действия лекарственных соединений является одним из перспективных направлений современной фармакологии. Учитывая, что появились новые принципиальные возможности для сиквенирования, встает вопрос о генетической паспортизации населения, когда каждому будет выдан его генетический паспорт, и человек будет решать проблемы своего здоровья. Важнейшим достижением прошлого века являются стволовые клетки, что стало возможным благодаря развитию всей эмбриологии и цитологии. Это позволило подойти к разработке путей создания искусственных органов, получать новые вещества, специфически влияющие на органы-мишени.