Генная инженерия

4. Пока плашка охлаждается,  готовят смесь для мечения.  Для этого в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл вносят 0,5 мкл ³⁵S-dATP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл разведенной смеси для мечения и 3,5 мкл воды.

5. Размечают поликарбонатную  микроплашку Techne 96® так же, как первую плашку, и в ячейки в ряду "Т" вносят по 2 мкл смеси для ddT-терминации. Аналогичным образом вносят смесь для терминации в ячейки остальных рядов и помещают плашку в термостат для микроплашек с температурой 42°С.

6. После охлаждения плашки (п. 3) в течение 30 мин добавляют  к смеси для мечения (для  каждой матрицы) последовательно  1,77 мкл буфера для разведения  фермента и 0,22 мкл фермента Sequenase® II. (Это позволяет держать фермент Sequenase® II вне холодильника минимальное время.)

7. По 2 мкл этой смеси  наносят на боковую стенку  ячеек, содержащих праймерную смесь, и центрифугируют плашку для перемешивания компонентов. Включают секундомер.

8. Через 2 мин начинают  переносить раствор из ячеек  первой плашки в соответствующие  ячейки предварительно нагретой  и помещенной в термостат поликарбонатной  плашки. Для этого используют  обычную микропипетку, быстро меняя  наконечники после каждой ячейки (помните, что использованные наконечники радиоактивны).

9. После того как перенесен  раствор из последней ячейки, включают секундомер и в наконечник на шприце Hamiltonнабирают стоп-раствор.

10. Через 5 мин наносят  по 5 мкл стоп-раствора на боковую  стенку каждой ячейки и центрифугируют  плашку. После центрифугирования плашку, закрытую крышкой, можно хранить в морозильнике до использования (при - 20°С ³⁵S-продукты можно хранить в течение недели).

Амплифицированные последовательности нуклеотидов можно увидеть в  УФ-свете после фракционирования продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза вприсутствии бромистого этидия. В большинстве случаев после ПЦР при наличии 1 - 10 нг ДНК-матрицы выявляется только одна полоса ДНК ожидаемой электрофоретической подвижности. Чувствительность и специфичность детекции продуктов амплификации значительной увеличиваются при использовании различных вариантов ДНК—ДНК-гибридизации с олигонуклеотидами-зондами, имеющими радиоактивную биотиновую, флюоресцентную или хемолюминесцентную метку. Это сделало возможным проведение работ с минимально возможным количеством материала, (например, с одной клеткой, одной копией гена) без предварительной его очистки.

В качестве исходной матрицы  для ПЦР может быть использована ДНК (или кДНК, полученная с помощью  предварительной обратной транскрипции РНК), выделенная как из свежеполученных клеток и тканей, так и из замороженных, высушенных или фиксированных препаратов, имеющих частично деградированные нуклеиновые кислоты, т. е. объекты, ранее недоступные для анализа. Так, с помощью методов ПЦР была амплифицирована, клонирована и секвенирована ДНК египетской мумии, продемонстрирована возможность анализа специфических участков ДНК при наличии одного волоса, клетки, сперматозоида в целях идентификации личности и пола хозяина.

Серповидно-клеточная анемия,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.  ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ ВИРУСОВ.

 

Филогенетический  анализ молекулярных данных является одним из подходов к теоретическому изучению структуры и функции генетических макромолекул (РНК, ДНК, белков) и их эволюционного преобразования. Основная цель филогенетического анализа - изучение эволюционного порядка дивергенции последовательностей генов и белков или их частей, а также восстановление списков эволюционных событий (замен нуклеотидов, делеций и вставок) в предковых линиях этих макромолекул.

Основным инструментом филогенетического  анализа является сравнение близких  по структуре или по функции генов  или белков, и прежде всего,  сравнение их первичных последовательностей.

Важнейшим свойством функционально  значимых структур макромолекул является их эволюционный консерватизм. Чем  меньше функциональная важность отдельных  участков генов, тем больше они имеют  тенденцию к эволюционной изменчивости. Так, например, псевдогены по-видимому полностью утратили функциональную активность.  Для них характерно быстрое накопление в ходе эволюции различных замен, делеций и вставок, разрушающих исходную структуру гена. С другой стороны, гистоны Н4, играющие важную роль в упаковке хроматина, почти не изменялись на протяжении всей эволюции животных.

Консервативность генов  позволяет выявить отдаленное родство  между их представителями, давно  разошедшимися в ходе эволюции и  выполняющими иногда разные функции. Однако для филогенетического анализа  необходимо и наличие определенного  уровня изменчивости генов. Мутации, делеции  и вставки являются своего рода метками, благодаря которым удается восстановить пути эволюции современных форм макромолекул. Гены с разной величиной консервативности пригодны для изучения разных эволюционных уровней. Сильно консервативные гены и  их продукты (гистоны, тРНК) нельзя , например, использовать для исследования эволюции отрядов и более мелких таксонов, но с успехом можно применять  для изучения эволюции более крупных  таксонов. Сильно вариабельные гены, наоборот, дают хорошее разрешение лишь на поздних  эволюционных этапах.                      

В последнее время метод  полимеразной цепной реакции  (ПЦР) с последующим анализом нуклеотидной последовательности широко используется для точной идентификации вирусов и определения их родства в отношении других штаммов. Для сравнительной характеристики геномов различных штаммов вирусов также проводят рестрикционный анализ ПЦР-продуктов. Обычно для построения филогенетического дерева используются данные последовательностей нуклеиновых кислот. Филогенетическое дерево очень ясно показывает родство между вирусами, если анализируется большое количество изолятов. Для этих целей существует много компьютерных программ. Наиболеепопулярные пакеты программ- PHYLIP(PHYLogeny Inference Package), PAUP(Phylogentic Analysis Using Parsimong),CLUSTAL иMEGA.            

Для филогенетического анализа  особенно интересны  РНК-содержащие вирусы, которые существуют как гетерогенные популяции. Их геном более генетически пластичен, чем геном ДНК-содержащих вирусов.             

Так, геном вируса бешенства, который относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae, представлен одноцепочечной негативной РНК длиной около 12000 пар оснований (п.о) , кодирующей пять основных белков.             

Белки подразделяются на три  функциональные группы: оболочечные (G ,M) нуклеокапсидный (N) и РНК-полимеразный комплекс, состоящий из L и NS белков. Белки N,NS и L вместе с вирионной РНК образуют нуклеокапсид , который окружен мембраной, содержащей трансмембранный гликопротеин G , ответственный за антигенные свойства вируса. Существование псевдогена  y  между G и L  цистронами , является отличительной особенностью вируса бешенства от вируса везикулярного стоматита.            

N-ген лиссавирусов, как показало клонирование и секвенирование, является наиболее консервативным по своей структуре из всех генов вируса бешенства.            

Mannen K.et al, в 1991 г. определили большую зависимость различий в N-гене от географической локализации, чем от хозяйской специфичности. В Онтарио вирус бешенства, который описан как единственный «Арктический» тип, разделили на четыре основных типа. Эти типы филогенетически разветвляются на две основные ветви , одна из которых состовляет один тип, вторая три основных типа, что отражает историческое передвижение вируса в регионе от середины к концу 50-х гг. Эпизоотия передвигалась на юг Онтарио с севера и Квебека. Изменения в последовательностиN-гена , определенных для 4-х вирусных типов, могут представлять генетический маркер для более существенных изменений  в других частях вирусного генома.             

Kissi et al представили первое сравнение между генотипами и молекулярными различиями N-гена внутри первого генотипа. Филогенетический анализ гена нуклеопротеина 82-х лиссавирусов подтвердил существование шести генотипов лиссавирусов, и также выделил изоляты бешенства первого генотипа в отдельные генетические линии. Изоляты с меньшей чем 80% нуклеотидной и 92% аминокислотной гомологией относятся к различным генотипам. Два коротких региона из 400 нуклеотидов, кодирующих аминоконец N-протеина, и 93 нуклеотида, кодирующих N-NS-регион, могут быть использованы для определения географического распределения основных вирусных линий. Выявлено два региона, имеющих наименьший уровень гомологии: участок длиной 199 пар оснований (нуклеотиды от 1080-го до 1278-го) и более протяженный фрагмент, расположенный между 99-м и 405-м нуклеотидами. Филогенетическое дерево построили, используя пакет программ MEGA. С их помощью получили дерево с ветвями, делящимися на 6 кластеров, которые соответствуют 6-ти генотипам. Сравнение изолятов показало, что в генетическом плане наиболее близкими оказались 4-й и 5-й генотипы, у которых уровень различий составил 79,8% (нуклеотидный уровень) и 93,3% (аминокислотный уровень) [Duvenhage virus (4) и EBL1(5)]. Внутри генотипа 1 наименьшее сходство среди изолятов из Азии и Латинской Америки – 83,3%; и наибольшее сходство в изолятах из Африки и Латинской Америки – 92,2%.

Филогенетический анализ изолятов 1-го генотипа вируса бешенства.             

Kissi et al. идентифицировали 11 филогенетических линий, взятых в соответствии с их географическим происхождением и видом хозяина: Африка 1а, Африка 1в, Африка 2, Африка 3, Азия, Арктика, Европа/Средний Восток, Латинская Америка 1 и 2 и две группы вакцинных штаммов. Филогенетическое дерево строилось на основании сравнения фрагмента или целого N-гена.            

Этот анализ позволил более  точно определить циркуляцию по зонам  и установить происхождение и  распространение бешенства для  некоторых линий, которые, возможно, произошли независимо на этом континенте от различных предшественников. Хотя циркуляция африканских вирусов 1а  и 1в более отлично от вирусов, распространенных в Европе и Среднем  Востоке, однако была выявлена генетическая связь между ними, что свидетельствует  об общем предке.            

Выяснено, что накопление большинства нейтральных мутаций  в географически разделенных  вирусных популяциях привело к значительным расхождениям в нуклеотидной последовательности гена нуклеопротеина.            

При исследовании гена нуклеопротеина 11-ти вирусов бешенства японскими  учеными было выявлено 9 отдельных  кластеров по гомологии менее 90% региона N-гена. Тем самым они подтвердили данные филогенетического анализа, полученные Kissi et al.             

Таким образом, варианты вируса бешенства, сгруппированные в соответствии с их географическим распределением, могут быть использованы для исследования эволюционного развития вируса бешенства.

 

 

 

 

 

 

 

 

4. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ  ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕКСТОВ.

 

Выявление и анализ закодированных в последовательностях функциональных  сигналов требует применения современных методов информатики - качественных баз данных с современными средствами  управления, новейших методов распознавания образов, статистических исследований,  применения специальных алгоритмов для преодоления возникающих вычислительных трудностей.

В настоящее время исследование функциональных свойств расшифрованных последовательностей нуклеиновых кислот - это  новый  раздел молекулярной биологии, граничащий с информатикой, с одной стороны, и молекулярной биофизикой  - с другой.  Можно с уверенностью сказать, что в настоящее время анализ последовательности  биополимера позволяет  извлечь  лишь очень небольшую долю закодированной в ней информации. В конечном счете точное выявление функциональных  особенностей  в последовательностях нуклеиновых кислот будет возможно только после детального исследования соответствующих реакций, осуществляемых нуклеиновобелковыми комплексами.

Для оперативной работы с  последовательностями создаются специальные банки данных. В банке в доступном для пользователя виде хранится каждая расшифрованная последовательность и ее паспорт, в котором указаны различные сведения о ней. Это сведения об организме, из которого выделена последовательность, о документе, где она описана, о расположении на ней регуляторных участков и белках, которые она кодирует и т.д. В настоящее время созданы три большие базы данных последовательностей нуклеиновых кислот: "Genbank" (Лос-Аламос, США  - более  30  млн. нуклеотидов), база данных нуклеотидных последовательностей  Европейской  молекулярно-биологической   лаборатории (EMBL,  Гейдельберг,  ФРГ - более 30 млн. нуклеотидов) и "Генэкспресс" (СССР, ВИНИТИ-ИМГ АН СССР - более 11 млн. нуклеотидов).  Известны  также  несколько  белковых баз данных, наиболее представительной из которой являетсяMBRF-PIR (США). Эти базы данных  распространяются  на  различных носителях - магнитных лентах и дисках, на оптических дисках.

Кроме построения филогенетических древ геномов вирусов компьютерный анализ применяется при поиске гомологий, распознавании кодирующих областей, функциональных сигналов, физическом (рестрикционном) картировании молекул  ДНК и для предсказания вторичных  структур РНК.

Сейчас в мире создано  большое количество программ ( обычно организованных в пакеты ) , предназначенных  для анализа последовательностей  нуклеиновых кислот и избавляющих  исследователей от многих трудоёмких рутинных операций , в том числе: подсчёт числа моно -, ди – и тринуклеотидов, перевод нуклеотидной последовательности в аминокислотную и т.д.

Все программы условно  делятся на два класса: общего назначения и специального. Первые осуществляют ряд_ наиболее распространенных операций по сбору и анализу последовательностей и позволяют: вводить и редактировать новые последовательности, считывать с помощью сканирующих устройств информацию непосредственно с автографов или гелей', находить участки узнавания эндонуклеаз рестрикции и представлять результаты в удобном (табличном или графическом) виде, находить участки с элементами поворотной и зеркальной симметрии (палиндромы), транслировать нуклеотидную последовательность в белковую во всех трех рамках считывания, сравнивать две последовательности методом точечных матриц гомологии, сравнивать новую последовательность со всеми данными Ген Банка, находить участки, обогащенные теми или иными нуклеотидами, вычислять гипотетическую температуру плавления ДНК, осуществлять автоматическую сборку секвенированных фрагментов в единую структуру - молекулу ДНК, транслировать белковую последовательность в нуклеотидную с учетом неравномерности использования кодонов-синонимов, определять молекулярную массу НК и белков, предсказывать вторичную структуру белков, вычислять свободную энергию образования шпилек и др.