Генная инженерия

Программы специального назначения создаются для решения более  специальных и часто более  сложных задач и представляют интерес для более узкого круга специалистов. Так, например, они могут выполнять ряд функций: вычисление длины фрагментов ДНК на основании их электрофоретической подвижности в гелях; выбор гибридизационных зондов; предсказание вторичной структуры РНК; локализация нуклеотидов в гене, которые могут быть изменены (без изменения аминокислотной последовательности) с целью введения сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции; нахождение участков с потенциально возможной структурой Z-формы ДНК; выявление функционально значимых участков в неизвестной вновь расшифрованной структуре на основании ранее выведенного консенсуса (в результате сравнительного анализа ряда известных структур с одинаковой функцией); локализацию участков, кодирующих белки, и т.д.

Для примера представлено меню пакета программ MICROGENIE, из которых следует, какие функции общего или специального назначения может выбрать исследователь при работе с нуклеотидными последовательностями.

Программа общего назначения "COMMON" обеспечивает ввод последовательности в ЭВМ, а также проверку введенных данных в диалоговом режиме. Они позволяют также редактировать нуклеотидные последовательности: вводить замены и вставки, исключать нуклеотиды, вырезать, встраивать и объединять нуклеотидные последовательности и таким образом моделировать гибридные и мутантные молекулы ДНК. Ввод последовательностей в память машины можно осуществлять вручную с клавиатуры, но в последнее время созданы приборы для автоматического сканирования авторадиограмм и секвениру-ющих гелей, полученных при использовании флуоресцентных меток , передачи данных сразу в компьютер и последующего анализа последовательности с помощью специальных программ. В недавно вышедшей в издательстве IRL(Оксфорд) книге "Анализ сиквенса нуклеотидных кислот и белков" подробно описываются как конструкция сканирующих устройств, так и программы для чтения авторадиограмм. Созданы программы для восстановления первичных структур высокомолекулярных ДНК на базе данных сиквенса фрагментов, полученных при ее Неспецифическом расщеплении (например, ультразвуком,). Родство между любой парой фрагментов ДНК выявляется на основании совпадения последовательности нуклеотидов в их структурах, причем эти совпадающие последовательности и являются местом перекрывания и такие два фрагмента могут быть объединены в более протяженную структуру. Процесс отбора фрагментов и стыковки продолжается до. тех пор, пока не будет восстановлена вся первичная структура исследуемой ДНК. Одной из такого рода программ является "CONTIG" (существует ее вариант для компьютера IBM PC), созданная в лаборатории Ф.Сангера (Кембридж, Англия). Ниже приводятся основные операции, которые позволяет осуществлять программа "CONTIG":

1) хранение сиквенса каждого  фрагмента;

2) отбор смежных фрагментов  и сборка последовательностей  из них;

3) сравнение данных, полученных  при чтении новых авторадиограмм, с уже установленными последовательностями;

4) объединение двух фрагментов  с помощью третьего, представляющего собой область перекрывания первых;

5) поиск участков ДНК,  комплементарных уже установленным,  что является проверкой правильности  сборки полной структуры ДНК.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

 

Метод Максама-Гилберта и  метод Сэнгера основаны на одном  принципе. В первом используется специфическое  расщепление ДНК, обусловленное  природой оснований, во втором -  статистический синтез ДНК, заканчивающийся на каком-либо одном из 4 нуклеотидов. Таким образом, основой обоих методов является получение полного (статистического) набора  фрагментов ДНК, оканчивающихся на каждом из четырёх нуклеотидов.

Химический метод (метод  Максама-Гилберта) проще использовать в том случае, когда исследуемая ДНК не слишком велика (200-500 звеньев). В том случае, если речь идет о секвенировании высокомолекулярной ДНК, лучше применять метод полимеразного копирования (метод Сэнгера) , чтобы не вводить процедуру рестриктазного расщепления с выделением индивидуальных фрагментов. При энзиматическом секвенировании протяженных одноцепочечных ДНК (например, бактериофагов) можно применять набор олигонуклеотидов-затравок, синтез которых в настоящее время не требует больших затрат времени и труда. Для двутяжевых высокополимерных ДНК наиболее удобен метод слепого энзиматического секвенирования с применением универсальной затравки (их выпускают многие фирмы) и обработки данных с помощью ЭВМ. Химический метод также может быть применен, но в этом случае необходимо вырезать из вектора исследуемые фрагменты ДНК, и это усложняет всю процедуру.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1 - 3. М.: Мир, 1994.     

2. Фаворова О. О. Лечение генами – фантастика или реальность? // Соросовский образовательный журнал. № 2. 1997. С. 21 – 27.    

3. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Ч. 1. Новосибирск: Изд-во Новосибирского ун-та, 1994. 304 с.     

4.  клиническая диагностика.Методы: Пер. С англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир, 1999.

5. Глебов О. К. Генетическая трансформация соматических клеток // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988.     

6. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.    

7. Борисюк Н.В. Молекулярно - генетическая конституция соматических гибридов // Биотехнология. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. М., 1988. Т. 9. С. 73 -113