Эмбрион трансплантациясы

1) донор-аналықтарды  сойып (зертханалық кеміргіштері  мен қара  мал шаруашылығында        

2) хирургиялық  (ұсақ және орташа жануарларды);

3) хирургиялық  емес (ірі көлемдегі жануарларда).

Әрбір трансплантация әдісінің оңда теріс те жақтары бар. Эмбриондар жуған кезде оны үш кезеңге бөледі: Дайындық кезеңі, Жуу  кезеңі және жуудан соңғы кезең. Қысқаша эмбриондар жуу әдісіне тоқталсақ, бірінші жануарларды сойып эмбриондарын алу    негізінен зертханалық тышқандардан эмбрион алғанда қолданылады. Оларға басқа эмбриондарды шығарып алу әдісі қолданылуы өте сирек кездеседі.

Осы мақсатта алдымен тышқанды арнайы камерада тұндырып, не мойын омыртқасын тайдырып өлтіреді. Ал осыдан соң жыныс жолын басқа  ткандардан ажыратады. Оларды керекті  жерлерінен кесіп Петри табақшасына  салады. Осыдан соң барып жұмыртқа жолдарынан эмбриондарын жуып алады.

Бірінші әдісті қолданғанда эмбриондарды зигота, алғашқы бөліну сатыларында жуып алса, екінші әдісті қолданғанда морула  және бластоциста сатыларында жуып алады. Бірінші әдіс бойынша донорларды овуляциядан кейін 12-48 (56 ) сағат өткеннен кейін сойса, екінші әдіс бойынша  овуляциядан 3-5 күн өткеннен барып  сояды. Кезінде әртүрлі механикалық  әсерлер жасайтын, нәтижесінде тканьдар тұтастығы бұзылатын эмбриондарды трансплантациялау әдісі –хирургиялық деп аталады.Қой мен ешкі, шошқада жыныс жолдарына трансплантация кезінде былай қол жеткізеді:

   Ішінің  ақ сызығы бойымен лапаротомия  жасалады (вентраль-   лапаротомия). Ол үшін жануар шалқасынан  жатқызылады, жергілікті анестезия  жалпы наркоз беріледі;

    Лапаротомия  жануар тік тұрған кезде жасалады. Операция аш бүйірден арнайы  аспап арқылы пайдаланылып жасалады (эффеминатор);

     Лапароскопия –әідіс арнайы аспап  лапароскопиялық троактор қолдануға  негізделген. Бекітіліп қойған (шалқасынан  жатқызылып), анестезияланған іш  қуысы тұсынан екі жерінен  онша үлкен  емес тілінеді (1,5-2 см): біріншісінен газ қоспасы  үріледі (100% -СО2, үрілу жылдамдығы 1л/мин, көлемі 2,5-5 литров), ал екінші  тесік гормональ индукцияланған  аналықтан бірінші тесікпен бірге  арнайы лапароскопиялық троактор  мен канюля арқылы манипуляция  жасап жұмыртқалық фолликулардан  5 мм сынап бағанынан асып кетпеуге  тиіс. Ол ішке енген иненің  сол қуысқа енгенін анық бақылау  үшін керек.Әдісті таңдау жұмыс  жүргізушіге байланысты. Бірінші  әдістің кең тарағанын айтуымыз  керек. Үшінші әдіс ооцитті  алып in vitro ұрықтандыру үшін қолданылады. Хирургиялық тілік алу үшін екі жуу әдісі қолданылады. Осыдан соң барып эмбрион жууға кіріседі.Эмбрион жуып алу үшін екі әдісі қолданылады:

1. Жатырлық. Мұндайда доғал инені жатыр мүйізінің жоғарғы ұшына сұғады да, шприцпен жуу сұйығын бифуркация бағытына жібереді;
2. Жатыр –түтіктік әдіс. Бұл әдістің өзін сұйықтықты жіберу бағытына қарай тағы да екі түрге бөледі.

а) эмбриондарды жатыр мүйізінен шығарып алу, басқаша айтсақ жуу сұйығын воронкада  жатыр мүйізіне қаратып жібереді (сиырлар мен шошқада);

 

 

 

Жануарлар эмбриондарын жуу

 

№	Жұмыс этаптары	Жуу әдістері
		Хирургиялық (вентраль лапаротомия әдісі )	Хирургиялық емес (трансцервикаль әдісі )
1     2     3       4                           5       6	Дайындық кезеңі   Жануарды  бекіту   Аурусыздан-дыру (обезболевание)   Репродукция органдарына қол жеткезетін жерді  дайындау                   Эмбриондар ды  жуып алу     Жуғаннан  кейінгі кезең	Аш диета, 24-36 сағат бойы	Жұмыртқалықты ректаль зерттеу, сары денені тексеру: аш диета, 18-24 сағат  бойы
		Операция столында, шалқасынан жатқызып	Станокта, тұрған күйінде: тазалау  клизмасы
		Жалпы (наркоз) немесе жергілікті	Басында етіші 5 мл рампунь егеді, ал соңынан эпидураль анестезия  жасайды (2%-тік новокаин, 10-15 мл )
		Операция  жасайтын жерді сабындап жуады, жүнін  қырып тастайды, 70% -тік спирітпен  дизенфекцйя жасайды, 5 % -тік йод  жағады. Операция жасайтын жерге жамылшы  жабады.	Сыртқы  жыныс органдарын сабындап жуады, ал артынан фурацилинмен жуады, 2%-тік  диоцидпен дезинфикациялайды.
		Ішкі жыныс органдарына қол  жеткізу үшін хирургиялық тіледі
		Әрбір жатыр мүйізін жууға 15-20 мл қоректік орта жұмсалады .	Әрбір жатыр мүйізін жууға 450-500 мл қоректік орта жұмсалады
		Іш  пен теріні кетгутпен тігеді. Жануарды операциядан кейінгі секцияға 2-3 күнге көшіреді (асқынбаған жағдайда)	Қынапқа өте аз дозада антибиотиктер ерітіндісін  ендіреді (барлық уақытта емес). Жануарды бір тәуілік бойы жеке ұстайды(асқынбаған жағдайда)

 

 

Қолданылып отырған жуу әдісіне  байланысты эмбриондардың даму сатысы

 

№	Көрсеткіштер	Эмбриондар жуу әдісі
		Хирургиялық	Хирургиялық емес	Сойғаннан кейн
1	Жануарлар түрі	Саулық	Сыир	Зертханалық тышқан
2	Соңғы шағалысудан кейінгі эмбриондар шығарып алу уақыты	12 сағаттан  соң, 4-5 күнге дейін	6-8 күн  аралығында	12 сағаттан  соң 5 күнге дейін
3	Шығарылып алынған эмбрионның даму сатысы	Зигота  – бастапқы морула	Морула - бластоциста	Зигота  бластоциста
4	Жуатын  сұйық жіберілетін жер	Жатыр мүйізінің негізінен жұмыртқа жолының  бахромкасына қарай	Жатыр денесінен мүйізіне қарай	Жұмырқа жолының воронкасынан жатыр мүйізіне қарай
5	Эмбрионды шығарып алады	Жұмыртқа  жолының бархромкасынан	Жатыр мойнынан қынап арқылы	Жатыр мүйізінен
6	Эмбриондардың алмастырғанда отырғызады -	Жұмыртқа  жолына не жатыр мүйізінің негізіне	Жатыр мүйізі не денесі	Жұмырқа жолына не жатыр мүйізіне

 

Жатыр мүйізінің  әрбір жағына кезекпен негізінен  түйрейді. Осы жерден қатетер тығылып, сол арқылы жуатын сұйық жұмыртқа жолының воронкасы бағытында  жіберіледі.Әрбір жатыр мүйзін жууға 15-20 мл қоректік орта жасалады. Сол сұйықпен бірге эмбриондар пробиркаға не Петри  табақшасына құйылады (эмбрионик). Оның көлемі 30мл-ге дейін жетеді. Хирургиялық эмбриондар шығарып алу Оны дереу овуляциядан кейін-ақ алуға болады (немесе күйге келген күннің ертесіне -ақ). Эмбриондар даму сатысы зиготадан бастап бастапқы морулаға дейін. Эмбриондар бұл уақытта әлі жатыр мүйізінің түбіне жетпейді. Қойдан эмбриондарды бұндай даму сату сатыларында күйге келгеннен бастап 1 күннен 5-6 күнгет дейін алуға болады.Эмбриондар жуғанда барлық механикалық әсерлер ткандар тұтастығын бұзбайтын болса-ондай әдісті эмбриондар жуудың хирургиялық емес жолы деп атайды. Ірі ауылшаруашылық жануарлардан, мысалы сиырлардан эмбрионды хирургиялық емес жолы (трансцервикальным) арқылы болады. Ол арнайы катерерлер арқылы жүзеге асырылады, оны қынап арқылы жатыр бағытында ендіру арқылы жасайды.Ізіне ректаль бақылай отырып бағыттайды. Бұлай жуған кезде катерлерді керекті жатыр мүйізіне ректаль бақылай отырып бағыттайды. Қалай катерер керекті тереңдікке дейін енген бойда баллонға 15-20мл –ге ауа сорып алады. Бұл жатыр мүйізінің кері жолын жауып қал мақсатында қолданылады. Осыдан соң жатыр мүйізіне жуатын сұйық беріледі. Эмбриондардың толық жуылуы үшін сұйықты көп керек ететінін айтып тиістіміз.Хирургиялық емес эмбриондар алу тәсілінде –эмбрион шығарып алу уақыты өте шектеулі. Жоғарыда айтылғандай хирургиялық емес әдіспен эмбрионды тек жатыр мүйізінен алуға болады. Демек, эмбриондарды олар жатыр мүйізіне түскеннен имплантация болғанынша алуға болады (дәлірек айтсақ, эмбриондар мөлдір қабықшасынан ажырағанша жақсы болады.). Даму сатыларына келсек моруладан қабықшасынан экспланцияланған бластоцистаға дейін. Сиырларда бұл эмбрион дәйкес келеді.Даму фазалары    сиыр       күйге келген күннен      бастап 7-ші,   8-ші күндері ал, сиырларда    бұл   эмбрион             сәйкес    келеді.Осылайша эмбрион алатын уақыт қолданылып жатқан трансплантация әдісіне байланысты болады.Жоғарыда айтылғандай, эмбриондар транспплантация асылтұқымды мал шаруашылығында өз орнын мықты тапты. Ол оның әртүрлі клетка технологиясын жануарлар генотипін эмбриондар деңгейінде «конструкциялауға болатынында».Алға қойылған эмбриоинженерлік міндеттерге орай эмбриондарды in vitro манипуляция жасауға болатындай уақытта жуып алу керек. Сондықтанда, клетка технологиясына байланысты эксперимент қоярда эмбриондар жуу әдісін таңдауда тек жануар көлемі ғана емес, сонымен бірге in vitro микроманипуляцияға керекті эмбриондардың даму сатысы да маңызды роль атқарады. Мысалы, егерде эмбриондарды трансгенозды жасау керек болатын болса, онда зиготаны екі пронуклеус даму сатысында алу керек. Ондай даму саысында алу үшін соңғы шағылыстырудан кейін 12 сағатта өткеннен жуып алу керек (in vitro ұрықтандыру)

 

Эмбриондарды жуу кезіндегі  даму сатысы мен биогеографиялық  орналасу

Индукцияланған цикл күні	«0»	«1»	«1-2»
Биологиялық процесс	Күйге келуі                 Суперовуляция                    Ұрықтану
Себебі мен салдары	Организмнің гормональ қаныққан статусы
	2-рет ұрықтан-  дыру: таңертең- кешке	Күйге келгеннен кейін 12 сағат өткеннен бастап 24 сағатқа созылады	Овуляциядан соң 2 сағат өткеннен бастап, 24-36 сағатқа  созылады
Донор репродукция-лық сапасының физиология-лық  ерекшеліктері.	Гармональ индукцияланған донорлардың күйге  келу уақыты ұзарады, орташа 6-12 сағатқа	Суперровуляцияланған  фолликулогенез мейоздың әртүрлі сатысындағы  ооциттердің дамуын қамтамасыз етеді (метафаза 1-ден бастап профазы ІІ-ге дейін). Қаныққан гармональ статусқа байланысты, ұзарған экструсқа байланысты- ооциттер әр мезгілде овуляцияланады. Сондықтан жұмыртқалықтағы полиовуляциялық  реакция шамада 10-24 сағатқа созылады.	Ұрықтану жұмырқа жолының ампуласында  жүреді.
Зиготалар жуу уақыты		Соңғы шағылысудан 12 сағат өткенен кейін	Соңғы шағылысудан 24-36 сағат өткенен кейін
Биогеографиялық орналасуы		Жұмыртқалық (овуляцияланбаған ооциттер)-жұмыртқа жолы ампуласы(овуляцияланған ооциттер).	Жұмыртқа  жолы ампуласы
Жуылғанда алынған ооциттер мен зиготалар  популяциясы		Ұрықтанбаған  ооциттер -10 % . Екі пронуклеус сатысындағы  зиготалар-80 % . Жетілген зиготалар - 10 % .	Ұрықтанбаған ооциттер -1%  Екі  пронуклеус сатысындағы зиготалар-10 % Жетілген зиготалар-80 %. 2-бластомер  эмбрион – 9 %

 

*- мәліметтер сиырлар мен қойлардың  орташа көреткіштері бойынша  алынған.

Бұл жағдайда хирургиялық емес жолмен сиырларда  эмбриондар жуу жай мүмкін емес. Өйткені екі пронуклеус зигота даму сатысы жұмыртқа жолының ампуласында  өтеді. Сондықтан эмбриондар жуу  әдісін таңдау мына факторларға байланысты:

   1) жануар  түрінде қарайды;

    2) жануар көлеміне қарайды (сиыр  мал шарушылығында, қой мал  шаруашылығында);

    3) клетка технологиясына қажетті,  эмбриондардың имплантациядан алдыңғы  керекті даму сатысы.

Эмбриондар алмастыру Эмбриондар алмастыру репродуктивті аналық-реципиент трактына жүргізіледі. Оның екі әдісі бар: хирургиялық (зертханалық жануарлар, қой, шошқа) және хирургиялық емес (сиыр). Алмастыру кезінде істелетін жұмыстар тәртібі әдістемедегімен бірдей:

Эмбриондар алмастырудың қарапайым  схемасы: а) жұмыртқа жолының воронкасына алмастырудың  хирургиялық әдісі; в) жатыр мүйізіне алмастырудың хирургиялық емес әдісі эмбриондар жуу кестесінде көрсетілген. Айырмашылығы кестедегі 5 пункт, жуу деген жерде эмбриондар алмастыру болады.

Реципиенттерге  эмбриондар алмастырғанда оны жұмыртқалықтың ипсилатераль жағына жасау керек (шошқаларда бұл факторды есепке алмаса да болады, себебі олардың эмбриондары миграцияға қабілетті). Ипсилатераль жағы дегеніміз  жұмыртқалықтың овуляция болған жағы.

Эмбриондарды  хирургиялық жолмен алмастырғанда  олардың даму сатысына орай, жұмыртқа жолына, жатыр мүйзіне, денесіне алмастырса, ал хирургиялық емес әдіс бойынша-жатыр  мүйзіне не денесіне алмастырады. Мұндай алмастыру мына тәртіпте жүргізіледі: алдымен жұмыртқалықта сары дене бар-жоғына қарап жұмыртқа жолының, не жатыр мүйізінің ипсилатераль жағы анықталып алады, соңынан барып  эмбрион сол жаққа алмастырылады. Хирургиялық әдіс кезінде эмбриондарды жұмыртқа жолына воронка арқылы немесе жатыр мүйіз түйреп ендіреді. Эмбриондар алмастыруға арнайы иілгіш тифлон катетер  қолданылады. Катетердің екінші ұшында көлемі 1-5 мл-ік шприц орнатылады.

Хирургиялық емес әдіс кезінде эмбриондар алмастыру  келесі тәртіп бойынша жүргізіледі: алдымен реципиент жатырына көмірқышқыл  газ үріледі, кейін эмбрионы бар  пайетаны Касса катетеріне орналастырады. Одан әрі ректаль қолмен бақылап  отырып, жатыр мойны арқылы жатыр  мүйіз ішіне жатыр мүйзі ішінен жатыр денесінен 5-7 см тереңдікке ендіреді. Осыдан соңкатетер штогын басып, пайете ішіндегісін эмбриондармен бірге  жатыр мүйзіне салып жібереді. Пайетені толтыру схемасы мынадай  – 1 – қоректік орта; 2- ауа, 3-эмбриондары  бар қоректік орта, 4-пайета тығыны.

Хирургиялық емес әдіс кезінде сары дененің алғашқы  даму сатыларында эмбрион алмастырумен байланысты манипуляцияларды жүргізуге  болмайды. Себебі, сары дене даму кезінде  болатын рогестереонның жоғарғы концнетрация жатыр еттері жиырылуын төмендетеді. Ол әрине эмбриондардың тасымалдау кезіндегі жатыр мүйзіне жабысуына оң әсер етеді.

Хирургиялық емес жолмен эмбриондар алмастырғанда  қолдан ұрықтандыруға пайдаланылатын аспаптар сияқты аспаптар пайдаланылады: пайетаға қоректік ортаны сорғызып алады (1,0-1,5 см), кейін ауа көпіргішін (0,5 см), одан әрі микроскоппен қарай  отырып негізгі керекті эмбрионы бар қоректік ортасы сорғызылады (2-3 см), осыдан соң тағы да аздап ауа  сорғызылады (0,5 см), соңынан қайтадан қоректік орта (1-1,5 см). Катетерді жатыр  мүйзіне енгізген кезде механикалық  тітіркеніс болдырмау мақсатында барынша  абай болу керек.Шектен тыс баяу да,жылдам да болуға тиіс емес.