Кальциевый насос животной клетки

 

Кальциевый насос животной клетки

 

Резюме   

Кальций-транспортная АТФаза - сравнительно небольшой белок, состоящий  из одной полипептидной цепи. Он выполняет важнейшую функцию - активный перенос ионов кальция через мембраны клеток, поддерживая тем самым низкую концентрацию этих ионов в клетке (10^-7 М) по сравнению с окружающей средой (3•10^-3 М). Хотя полная пространственная структура фермента еще не раскрыта, основные стадии его работы выяснены, и теперь нам понятно, каким образом энергия гидролиза АТФ тратится на перенос Ca²⁺ из области меньших в область больших концентраций этих ионов.

Введение   

В цитоплазме клеток концентрация ионов кальция составляет всего 50-100 нМ (5·10^-8 - 1·10^-7 М), тогда как в окружающей клетки среде она равна примерно 3 мМ (3·10^-3 М). Поддерживает эту разницу в концентрации (на четыре порядка величины!) система активного транспорта ионов кальция, главную роль в которой играет кальциевый "насос" - фермент кальциевая АТФаза, сокращенно Са-АТФаза. Точнее говоря, не один фермент, а группа кальциевых АТФаз, различающихся по локализации в клетке, строению и способу регуляции.    

Но все эти ферменты переносят ионы кальция из клеточного сока во внеклеточную жидкость или  во внутриклеточные депо кальция - пузырьки эндоплазматического ретикулума за счет энергии гидролиза АТФ, поддерживая тем самым низкую концентрацию ионов кальция в цитоплазме.    

Поддержание низкой концентрации ионов  кальция в цитоплазме покоящихся клеток создает возможность регуляции  клеточных функций путем увеличения проницаемости клеточных мембран для Ca²⁺: входя в клетку, эти ионы активируют великое множество различных внутриклеточных процессов. Яркий пример - сокращение мышцы, которое начинается с выхода ионов кальция из саркоплазматического ретикулума и его взаимодействия с сократительными белками.    

Под действием электрического импульса, распространяющегося по плазмалемме, ионы кальция выходят из везикул  саркоплазматического ретикулума и  вызывают сокращение. Удаление кальция  саркоплазматическим ретикулумом  приводит к расслаблению мышцы. Последующее удаление Ca²⁺ из цитоплазмы и накопление его в ёмкостях эндоплазматического ретикулума осуществляется Са-АТФазой и приводит к расслаблению мышцы (см. рис.1).

P и с. 1. Ионы кальция  как регуляторы цикла сокращение - расслабление в поперечнополосатых  мышцах: ТЦ - терминальные цистерны саркоплазматического ретикулума (СР), ЛТ - продольные (латеральные) трубочки, ВС - внутренний синапс, ТТ - Т-система, Ц - цитоплазматическая мембрана (плазмалемма), A - миозиновые нити, I- актин, Z - Z-пластинка, М - М-полоса.

 

   В других клетках ионы кальция, входя пассивно через открывающиеся каналы, связанные  с различными рецепторами, также играют роль посланников, дающих приказы включить ту или иную внутриклеточную систему . После исполнения приказа "посланников" надо выпроводить из цитоплазмы, что и делают Са-АТФазы, а также Na⁺-Ca²⁺ обменники.    

Кальциевые АТФазы, входящие в состав цитоплазматических мембран и внутриклеточных мембран, различаются по ряду свойств. Все Са-АТФазы представляют собой мономерные белки, т. е. состоят из единственной полипептидной цепи, но несколько различаются по молекулярной массе. Так Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума имеет молекулярную массу 108 кД, а плазматическая Са-АТФаза - 120 кД. Лучше всего изучена Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума поперечно-полосатых мышц, и именно ее строение и работу мы рассмотрим подробно в данной статье.

Выделение и  очистка Са-АТФазы   

Изучение механизма  транспорта Са²⁺ при работе Са-АТФазы проводилось, главным образом, на изолированных пузырьках саркоплазматического ретикулума, полученных после гомогенизации тканей путем последовательных центрифугирований. Пузырьки СР в электронном микроскопе выглядят так же, как и другие мембранные структуры. На сколах замороженных суспензий изолированных пузырьков саркоплазматического ретикулума видны внутримембранные частицы диаметром около 9 нм.    

Эти глобулярные частицы на поверхности скола образуются вследствие внедрения в гидрофобную зону мембраны участков полипептидной цепи Са-АТФазы. Анализ белкового состава пузырьков показывает, что основным белком в ретикулуме является Са-АТФаза (70-80% всех белков). Используя различные приемы, можно очистить Са-АТФазу от других белков. Правда, при очистке обычно повреждается мембрана, и изучать транспортную функцию становится невозможным. Но добавив фосфолипиды, удается восстановить целостность везикул и получить прекрасный объект для изучения функции Са-АТФазы: фосфолипидные пузырьки со встроенным в них работающим ферментом.

Энергетика транспорта ионов кальция   

Используя различные  методы, удалось установить, что  при гидролизе одной молекулы АТФ Са-АТФаза СР переносит 2 иона кальция из окружающей среды внутрь везикул, как это показано на рис. 2.

Рис. 2. Схематическое  изображение везикулы саркоплазматического ретикулума со встроенной молекулой Са-АТФазы Во внешнюю среду (цитоплазму) обращена головка фермента, диаметром около 9 нм. С ней связываются АТФ и ионы кальция. Мембрану пронизывает канал, по которому, как полагают, кальций переносится при гидролизе АТФ. Более подробная схема строения фермента показана на рис. 4.

 

   Перенос ионов кальция сопровождается переносом  электрических зарядов, но разность потенциала на мембране не удерживается, потому что мембрана СР хорошо проницаема для других ионов. Для того чтобы перенести через мембрану 2 грамм-эквивалента ионов кальция из клеточного сока, где его концентрация C_i = 1·10^-7 М, во внутреннюю полость саркоплазматического ретикулума, где концентрация кальция близка к одному мМ (C_o = 1·10^-3) требуется затратить энергию, равную:

DG = 2Dm = 2 [Dm_o + RT ln(C_i/C_o) + zFDj) (1)    

Поскольку внутри саркоплазматического ретикулума потенциал равен внутриклеточному (Dj = 0), а величина mo примерно одинакова для ионов кальция в водных растворах (Dm_o = 0), можно считать, что изменение свободной энергии при переносе двух молей Ca²⁺ равно при 37^оС (310 К):

DG = 2RTln (C_i/C_o) = 47,5 кДж/моль (2)    

Это приблизительно равно энергии  гидролиза макроэргической связи  АТФ при физиологических концентрациях  АТФ , АДФ и ортофосфата. Таким  образом, транспорт кальция через мембрану саркоплазматического ретикулума осуществляется с высоким коэффициентом полезного действия, без потерь энергии. Помимо прочего, это предполагает обратимость работы Са-АТФазы. И действительно, было показано, что можно получить синтез АТФ из АДФ и фосфата, если нагрузить изолированные везикулы СР кальцием, а затем убрать кальций из окружающей среды, добавив туда комплексон - соединение, связывающее Ca²⁺. Заметим, что обратимо могут работать также и другие транспортные АТФазы: Na/K-АТФаза цитоплазматических мембран и H⁺- АТФаза митохондрий.

Механизм переноса ионов кальция   

Хотя транспортные АТФазы и называют ионными насосами, от корабельной  помпы их отличает то, что они  не качают жидкость, а переносят  дискретные частицы - ионы. Каждый цикл переноса включает в себя как минимум три стадии:

1. 1.     частицу надо захватить с одной стороны мембраны,
2. 2.     перенести ее через мембрану (транслокация) и
3. 3.     выпустить с другой стороны

 

   Осуществление этих стадий сопряжено  с расходом энергии и следовательно одновременно что-то должно происходить с АТФ. Сама молекула АТФ тоже должна быть (1) захвачена и (2) гидролизована с запасанием энергии и расходом ее на перенос кальция, а продукты, АДФ и фосфат, должны перейти из связанного с ферментом состояния в водный раствор (3). В каждом цикле фермент одновременно использует не один, а два субстрата: внутриклеточный кальций и АТФ, - и образует три продукта: кальций, накопленный внутри везикул эндоплазматического ретикулума, АДФ и ортофосфат.   

Усилиями многих ученых была в общих  чертах расшифрована последовательность стадий при работе Ca-АТФазы (см. рис. 3), которая включает в себя все перечисленные выше этапы и кроме того замечательна тем, что стадии "переработки"АТФ как бы чередуются со стадиями переноса Ca²⁺.

Рис. 3. Последовательность стадий работы Са-АТФазы 1 - связывание ионов  кальция, 2 - связывание АТФ, 3 - образование фермент-фосфата, 4 - отщепление ионов кальция, 5 - гидролиз фермент-фосфата, 6 - возвращение фермента в исходное состояние. Остальные объяснения даны в тексте.

 

   Вот эти стадии:

1. 1.     Связывание двух ионов кальция на поверхности АТФазы, обращенной в цитоплазму (или наружу в изолированных пузырьках СР).
2. 2.     Связывание на той же поверхности молекулы АТФ.
3. 3.     Фосфорилирование белка (образование фосфофермента) и высвобождение АДФ.
4. 4.     Высвобождение ионов кальция с поверхности АТФазы, обращенной внутрь пузырьков СР.
5. 5.     Гидролиз фосфатной связи и отщепление ионов магния.
6. 6.     Переход молекулы фермента в исходное состояние (центры связывания кальция оказываются опять на поверхности пузырьков СР).

 

   В последующих разделах эти стадии будут рассмотрены более подробно.

Связывание ионов  кальция(стадия 1)   

Чтобы изучить количественно  способность везикул СР связывать  ионы, к суспензии везикул с  известной концентрацией АТФазы (Ca) добавляют разные количества изучаемых  ионов и тем или иным способом измеряют концентрацию связавшегося (C_b) и оставшегося в растворе иона (C_f). На основе полученных данных рассчитывают два основных параметра связывания: константу связывания (K_b)и число мест связывания (n). 
   Константа связывания - это константа равновесия:

свободные ионы +вакантные места связывания«связанные ионы

 
   По определению, константа связывания равна:

(3)

 

   Из  уравнения видно, что константа связывания K_b равна обратной концентрации свободных ионов при такой их концентрации C_f, когда концентрация связанных ионов C_b равна концентрации свободных мест связывания n_f , т. е. когда занята половина всех имевшихся на поверхности фермента мест связывания. Чем выше константа связывания (т. е. сродство центров к иону), тем ниже концентрация ионов, при которой белок еще может их связывать.    

Изучение связывания различных ионов мембранными  пузырьками СР показало, что только для ионов Са²⁺ имеются центры с высокой константой связывания (2·10⁶М^-1); на одну молекулу АТФазы приходится два таких центра.

Т а б л  и ц а 1 Константы связывания Ca²⁺ и АТФ с Са-АТФазой

Метод определения	Константа связывания Ca2+	Константа связывания ATP
Связывание 45Ca2+ или 14С-АТФ	4·106	2·105
Зависимость АТФазной активности от концентрации	2·106   2,5·106	2,5·105
Зависимость скорости образования  Е~ Р от концентрации	106	2·105

 

   Пользуясь уравнением 2, подсчитаем, какая доля всех центров связывания кальция будет занята ионами при концентрации свободных ионов в растворе, равной 1•10^-7М. Поскольку общее число мест связывания n = C_b + n_f, то из уравнения 2 нетрудно найти долю занятых центров связывания:

(4)

 

   Подставив значения C_f и K_b в уравнение 3, находим:

(5)

 

   Таким образом каждый шестой центр связывания на поверхности молекул АТФазы занят ионами кальция при той чрезвычайно низкой (100 нМ) их концентрации, которая типична для внутриклеточного содержимого.    

Конечно, сразу возникает  вопрос, является ли связывание кальция  действительно первой стадией его переноса или перенос и адсорбция кальция - разные и независимые процессы. Было получено много доказательств того, что именно связывание кальция с центрами с высоким сродством есть первая стадия переноса. Одно из них заключается в одинаковой зависимости связывания и переноса от концентрации кальция. С другой стороны, всякое снижение связывания под действием конкурирующих ионов всегда одновременно снижало и перенос кальция через мембраны. Заметим, что присутствие магния мало влияет на связывание кальция АТФазой, поскольку сродство к Ca²⁺ у центров связывания в 30 000 раз выше, чем к Mg²⁺.

Связывание АТФ(стадия 2)   

Изучение связывания АТФ с кальциевой АТФазой, встроенной в мембранные везикулы, показало, что  АТФ связывается в комплексе с ионами Mg²⁺ (или Mn²⁺), причем связывание комплекса Mg·АТФ происходит независимо от Са²⁺. Это означает, что имеются два разных центра связывания для Mg·АТФ и для Са²⁺.Константа связывания Mg·АТФ составляет 2·10⁵ М^-1, т. е. сродство активного центра фермента к субстрату довольно велико: половина молекул АТФ связывается при его концентрации 5 мкМ. Наряду с одним центром связывания, обладающим высоким сродством к АТФ, на поверхности молекулы АТФазы есть второй центр связывания с низким сродством, который не участвует в процессе гидролиза АТФ и переноса кальция, но, возможно, имеет значение для регуляции активности фермента.