Контрольная работа по «Биотехнология лекарственных среств»

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Тюменская  государственная медицинская академия

Министерства  здравоохранения и социального  развития »

(ГОУ  ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития)

Кафедра фармацевтической технологии 
 
 
 
 
 
 
 
 

Контрольная работа по дисциплине «Биотехнология лекарственных среств»

Вариант № 3 
 
 
 
 
 
 
 

Исполнитель: студент (ка)

заочного  отделения

фармацевтического факультета,

VI курс 6 группа

Горбунова (Чернова) Надежда Сергеевна 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Тюмень, 2011 г.

 

Тема 1

3.Назовите биообъекты  растительного происхождения используемые  в культуре ткани для получения  лекарственных веществ (не менее  8). Примеры использования (донор,  донатор). 

В нашей  стране заготавливаются десятки  тысяч тонн ЛРС. Однако потребность в БАВ, содержащихся в растениях, с каждым годом возрастает, а природные запасы лекарственных растений снижаются вследствие интенсивной урбанизации, освоения новых пахотных земель, сокращения лесных угодий и т.д.

Указанные обстоятельства потребовали изыскания новых путей получения БАВ. Одним из них является принципиально новый метод получения этих веществ, основанный на использовании в качестве сырья изолированных тканей и клеток, растущих на искусственных питательных средах. Доказано, что в этих условиях растительные клетки способны синтезировать различные БАВ подобно тому, как это происходит при выращивании самого растения. Кроме того, клетки культуры тканей могут быть использованы для биотрансформации ряда БАВ. Все это дает возможность разработки технологии получения БАВ, обладающих различным фармакологическим действием.

Исследования  в области культуры тканей и клеток различных растений проводятся в  последние десятилетия во многих странах, особенно в США, Англии, Японии. Основные направления исследований — получение штаммов культур лекарственных растений и скрининг выделяемых ими БАВ, полученных в условиях культур тканей растений, для выявления наиболее эффективных ЛВ.

Научные основы метода культуры тканей высших растений начали разрабатываться в  нашей стране в 1959 г. в Институте физиологии растений АН СССР им. К.А. Тимирязева. Здесь проведены исследования культуры ткани мака снотворного — источника морфиновых алкалоидов. Учитывая сложность синтеза этой группы алкалоидов и ликвидацию посевов мака снотворного, культура его ткани остается единственным путем получения алкалоидов группы морфина.

Систематические исследования культуры ткани раувольфии змеиной и жень-шеня проведены  в С.-Петербургской химико-фармацевтической академии. Разработана оригинальная технология выращивания тканей. Активизируются работы в ВИЛАР по культивированию тканей таких ЛР, как крестовник ромболистный, скополия гималайская, наперстянка шерстистая и красная, паслен дольчатый, диоскорея дельтовидная, стефания гладкая и др. Экстракцию алкалоидов можно производить как из высушенной (выход до 88%), так и из сырой (до 80%) биомассы. Технология выделения алкалоидов из биомассы мало отличается от их получения из ЛРС.

 

Тема 2

3.Методика слияния   протопластов и получение новых  гибридных молекул в качестве целевых продуктов. 

Слияние протопластов (парасексуальная гибридизация)

Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной  стенки, могут сливаться между  собой. Слияние протопластов - своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить:

1.скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов),

2.получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого,

3.слияние трех и более клеток,

4.получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей,

5.перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение,

6.получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.

Парасексуальная гибридизация важна для анализа  как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков - скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно)  свидетельствует о физическом сцеплении генов.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных  культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен  ряд методов, как физических, так  и химических.

При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2 - 3 протопластов, либо цепочки из 5 - 6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и  протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов.

В основе слияния  лежит различное действие постоянного  и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое  поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику "ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са2+", которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 - 11, концентрация Са2+ 100 - 300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция - их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой.

При слиянии  протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния - АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также  методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью  разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции - желто-зеленый и красный.

Протопласты могут  сливаться как попарно, так и  в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Бутенко Р.Г. в 1975 году.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после  слияния протопластов может быть различной:

1. Ядерные генетические  детерминанты наследуются как  дву-, так и однородительски. В  последнем случае ядра не сливаются  и впоследствии сегрегируют в  процессе клеточных делений.

2. Внеядерные  генетические детерминанты наследуются  двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов.

3. Возникновение  гибридных клеток и растений  в результате слияния более  чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) - растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984).

При слиянии  могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный  набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.

Гибриды могут  быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения – регенеранты.

 

Тема 3

3.Ферменты используемые  в генетической инженерии (рестриктазы,  лигазы) и механизм их действия. 

Возможности генной инженерии

Первые трансгенные  растения (растения табака со встроенными  генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения  всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgen", а также гербицид-устойчивая соя компании "Monsanto". Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

В настоящее  время получением и испытанием генетически  модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более ста миллиардов долларов. В 1999 г. трансгенные растения были высажены на общей площади порядка 40 млн. га, что превышает размеры такой страны, как Великобритания. В США генетически модифицированные растения (GM Crops) составляют сейчас около 50% посевов кукурузы и сои и более 30-40% посевов хлопчатника. Это говорит о том, что генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки. В ближайшие годы ожидается дальнейшее быстрое увеличение площадей, занятых трансгенными формами культурных растений.

Первая волна  трансгенных растений, допущенных для  практического применения, содержала  дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.