Контрольная работа по «Биотехнология лекарственных среств»

Еще в начале 90-х годов появились статьи, в  которых рассматривались перспективы  использования сапротрофной микрофлоры как продуцента биологически активных веществ (БАВ). Предполагается вводить в организм сапрофитные микроорганизмы, которые могли бы жить в условиях симбиоза с нормальной микрофлорой организма. Вещества, вырабатываемые бактериальными штаммами включаются в систему биохимических процессов организма. В случае нарушения нормального биохимического статуса организма они корректируют его, а при патологическом процессе – задерживают его или способствуют прекращению. Такое введение получило название «микробиологическая подсадка». К 1992 году было описано уже более 50 таких штаммов и проанализирован диапазон биологических эффектов секретируемых БАВ.

Для лечения  широкого спектра заболеваний (бактериальные  инфекции кишечника, дыхательных путей, гнойных инфекций, аллергий) успешно применяются штаммы Bacillus subtilis (препарат «Бактисубтил», например, используют при лечении диареи). Штаммами E. coli лечат ряд кишечных заболеваний. БАВ, секретируемые сапротрофами, могут регулировать ферментативные процессы в организме и вступать во взаимодействие с поступающими в организм ксенобиотиками. Штаммы можно получать непосредственно от человека, тогда они будут представлять его естественную микрофлору.

Можно целенаправленно  выводить лабораторные мутантные штаммы, в том числе методами генной инженерии и вводить их в организм. Способы введения могут быть различны: капсулы, растворимые в кишечном соке, культуры штаммов-продуцентов на пленочной основе, в виде свечей, а при легочных заболеваниях – в виде аэрозолей.

Новым направлением в медицине является использование ферментных препаратов типа «контейнер», изготовление которых стало возможным появлению и совершенствованию методов иммобилизации веществ. Эти препараты представляют собой микросферы с более или менее твердой и проницаемой оболочкой. Назначение этих лекарственных препаратов различное. Первым типом «искусственных клеток» следует назвать микрокапсулы. Фермент, находящийся внутри оболочки, не контактирует с жидкостями и тканями организма, не разрушается протеиназами, не ингибируется, не вызывает иммунного ответа организма. Основное достоинство микрокапсул заключается в том, что их можно имплантировать в нужное место, например в непосредственной близости от опухоли. При этом микрокапсула с соответствующим содержанием будет перерабатывать метаболиты, необходимые для роста опухолевой ткани, и эта ткань не будет развиваться. Капсулы могут содержать микроскопические участки тканей. Например, имеются экспериментальные данные по созданию депо инсулина путем имплантации микрокапсул, содержащих островки Лангерганса, синтезирующие в поджелудочной железе инсулин. Известно, что терапии диабетических заболеваний уделяется много внимания. Имплантация лекарственного начала избавила бы пациентов от ежедневных инъекций инсулина. Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут забивать кровеносные сосуды и, следовательно, являться причиной образования тромбов. Однако эффективность микрокапсул при использовании их в виде колонок для диализа в аппарате «искусственная почка» несомненна. При этом объем аппаратов и, соответственно, количество необходимых и очень дорогих растворов резко сокращается. Например, для микрокапсулированной «искусственной почки» требуется колонка объемом всего 30 мл, которая работает почти в 100 раз быстрее обычного аппарата. Развитие такой техники сдерживается пока высокой стоимостью, а также необходимостью использовать уже существующую тоже очень дорогую технику. Вероятно, ферментные реакторы на микрокапсулах будут применяться для деградации недиализуемых материалов.

Внутрь микрокапсул  могут быть включены магнитные частицы. В этом случае извне подводят магнитное  поле и препарат удерживают вблизи органа-мишени.

В ряде случаев  используются высокомолекулярные соединения, растворимые в определенных условиях и сохраняющие высокую прочность оболочек в других. Так ведет себя ацетилфталилцеллюлоза, микрокапсулы из которой интактны в желудочном соке и растворяются в кишечнике, освобождая содержимое. Сейчас интенсивно исследуются свойства микрокапсул, стенка которых состоит из оболочек эритроцитов. Содержимое эритроцитов удаляется, а «тень» заполняется ферментом. Серьезные успехи достигнуты при лечении аспарагин-зависимых опухолей препаратами аспарагиназы в оболочках эритроцитов.

Используются  оболочки и других клеток. Так, описаны лекарственные препараты, включенные в оболочки макрофагов. Последние имеют тенденцию накапливаться в очагах воспалений, а следовательно, могут транспортировать туда как низко-, так и высокомолекулярный лекарственный препарат. Существенной положительной стороной «теней» клеток в качестве носителя является их полная совместимость с организмом пациента, поскольку этот носитель готовят на основе клеток, выделенных из крови пациента, и возвращают их ему же с новым содержимым. Задача введения лекарственного препарата в клетки может быть решена путем создания контейнеров-переносчиков типа липосом или мицелл. Оболочка липосомы представляет собой однослойную или многослойную поверхность, образованную, в свою очередь, бислойной структурой, созданной соединениями, имеющими два гидрофобных, достаточно протяженных участка и гидрофильную группу. Гидрофобные концы слипаются между собой и образуют пленку, обе стороны которой гидрофильны. Липосома, специфически или неспецифически адсорбировавшись на клетке, может быть поглощена ею путем фагоцитоза, и фермент внутри высвобождается.

Хорошо известно, что протеиназы, расщепляя денатурированные белки, способствуют очищению ран, и  следовательно, их заживлению. В этом направлении в клинической практике с помощью иммобилизованных протеиназ сделано многое. В качестве носителей для иммобилизации протеолитических ферментов наиболее употребимы волокнистые материалы на основе целлюлозы, поливинилового спирта, солей альгиновой кислоты, полиамидное и коллагеновое волокно. Готовят нити, в которые при формовании включают фермент и используют их в качестве шовного материала. Сравнительный анализ действия нативных и иммобилизованных протеиназ (в основном химотрипсина, трипсина, коллагеназы) показал, что уже на 2—4-й день рана очищается от некротических масс и по крайней мере вдвое быстрее наступает грануляция. Убедительные результаты получены при лечении трофических язв, лучевых язв кожи. Особенно эффективны иммобилизованные протеиназы при предоперационной подготовке и после пластических операций. Иммобилизованные протеолитические ферменты с большим успехом применяются в лечении гнойных заболеваний легких и плевры.

Биодеградация ксенобиотиков 

В удалении ксенобиотиков  из окружающей среды важны несколько  факторов:

-устойчивость  ксенобиотиков к различным воздействиям;

-растворимость  их в воде;

-летучесть ксенобиотиков;

-рН среды;

-способность  ксенобиотиков поступать в клетки  микроорганизмов;

-сходство ксенобиотиков  и природных соединений, подвергающихся  естественной биодеградации.

Для биодеградации ксенобиотиков лучше использовать ассоциации микроорганизмов, так как они более эффективны, чем отдельно взятые виды. При этом типы связей в подобной ассоциации могут быть различны. Один вид микроорганизмов может непосредственно участвовать в разложении ксенобиотиков, а другой – поставлять недостающие питательные вещества. Это может быть метаболическая «атака» на субстрат, когда синтезируются разные компоненты ферментативного комплекса, или же цепочка ферментативных реакций (многосубстратные конверсии) и т.д.

Особенно трудно разлагаются такие биоциды, как  детергенты, пластики и углеводороды. Самыми способными к борьбе с загрязнителями различного типа являются представители  рода Pseudomonas – они практически  «всеядны». Клетки этих микроорганизмов  содержат оксидоредуктазы и гидроксилазы, способные разлагать большое число молекул углеводородов и ароматических соединений, таких как бензол, ксилол, толуол. Гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе плазмид. Например, плазмида OCT отвечает за разложение октана и гексана, XYL – ксилола и толуола, NAH – нафталина, CAM – камфары. Плазмиды САМ и NAH обеспечивают собственный перенос, индуцируя скрещивание бактериальных клеток; остальные плазмиды могут быть перенесены только в том случае, если в бактерии введены другие плазмиды, обеспечивающие скрещивание.

В 1979 г. Чакрабарти (в то время совместно с компанией  «Дженерал электрик») после успешных скрещиваний получил штамм, содержащий плазмиды XYL и NAH, а также гибридную  плазмиду, полученную путем рекомбинации частей плазмид САМ и ОСТ (сами по себе они несовместимы, т. е. не могут сосуществовать как отдельные плазмиды в одной бактериальной клетке). Этот штамм способен быстро расти на неочищенной нефти, так как он метаболизирует углеводороды гораздо активнее, чем любой из штаммов, содержащих только одну плазмиду. Штамм может быть особенно полезен в очистных водоемах для сточных вод, где можно контролировать температуру и другие внешние факторы.

Эти микроорганизмы удобно использовать для очистки  нефтяных пятен на суше или море при различных авариях. Для большей эффективности создают микроэмульсию, содержащую бактериальные штаммы и капсулы со смесью основных питательных элементов - азота, фосфора и калия внутри. Добавление этих веществ стимулирует размножение бактриальных штаммов. Применение такого метода позволяет очистить от 70 до 90% загрязненной поверхности, за это же время очищается всего порядка 10-20% необработанной поверхности.

Преимущество  бактериальной очистки по сравнению  с химической в том, что она  не вызывает появления нового загрязняющего агента в окружающей среде. Плотность фитопланктона после бактериальной очистки повышается. Некоторые микроорганизмы способны изменять молекулу ксенобиотика и делать ее доступной и привлекательной для других микроорганизмов («кометаболизм»). Примером может служить разложение инсектицида паратиона под действием двух штаммов Pseudomonas – P. aeruginosa и P. stuzeri. В некоторых случаях происходит неполное превращение молекулы ксенобиотика - фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д., результатом которого является утрата этим веществом токсичности.

Одним из сильных  загрязнителей является ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная  кислота). Причина в том, что ЭДТА связывает тяжелые металлы, способствуя  их накоплению в почве. Бактрии родов Pseudomonas и Bacillus способны за две недели разрушить все связи комплекса Fe-ЭДТА. Эти бактерии успешно применяются для очистки бытовых сточных вод, куда попадают детергенты моющих средств. Кроме Pseudomonas, биодеградацию ксенобиотиков могут осуществлять и представители родов Acinetobacter, Metviosinus.

Однако, в некоторых  случаях внесение этих микроорганизмов  в почву может изменить экосистему местности. Избежать этого можно  ограничивая время жизнедеятельности  бактерий. Например, облучая штаммы ультрафиолетом, получили мутант, ауксотрофный по лейцину. Бактерии размножают в питательной среде, содержащей лейцин. Суспензией микроорганизмов в питательной среде пропитывают древесную стружку, которую разбрасывают по загрязненной территории. Количество лейцина рассчитывается на время, достаточное для уничтожения вредных примесей, поэтому после очистки мутантные штаммы гибнут.

Еще эффективнее, чем бактерии, справляются с посвенными загрязнителями грибы. Они могут  разрушать такие вещества, как пентахлорбензол, пентахлофенол. В одном из экспериментов грибами обработали около 10000 тонн почвы с территории деревоперерабатывающего комплекса. В этой почве содержание пентахлорфенола достигало 700 мг/кг, но за год деятельности оно снизилось до 10 мг/кг, что является допустимой нормой. Бактерии смогли бы переработать эту почву лишь за 4-5 лет. Грибы активны и зимой, разрушают высокомолекулярные полиароматические углеводороды, действуют внеклеточно, выделяя неспецифические ферменты. Стоимость грибной и бактериальной очистки одинаковы, но применение грибов позволяет сокращать сроки деградации и существенно удешевляет ее.

Рекультивация земель 

Данный комплекс работ проводится согласно требованиям  Постановления Правительства Российской Федерации 23.02.94 №140 «О рекультивации земель, снятии, сохранении и рациональном использовании плодородного слоя почвы» и «Основных положений о рекультивации земель, снятии, сохранении и рациональном использовании плодородного слоя почвы», утвержденных Приказом Минприроды России и Госкомзема от 22 декабря 1995 г. № 525/67. Проведении работ, связанных с нарушением почвенного покрова и рекультивацией земель, соблюдение установленных экологических и других стандартов, правил и норм при являются обязательными.

Рекультивация нарушенных земель - это комплекс работ направленный на восстановление продуктивности, хозяйственной ценности и улучшений условий окружающей среды для сельскохозяйственных, лесохозяйственных, строительных, рекреационных, природоохранных и санитарно-оздоровительных целей.

Рекультивации подлежат земли нарушенные при проведении:

-строительных;

-мелиоративных; 

-лесозаготовительных; 

-геолого-разведочных; 

-эксплуатационных;

-проектно-изыскательских  и иных работ, связанных с  нарушением почвенного покрова. 

Рекультивация земель включает в себя:

-осуществление проектно-изыскательных работ: почвенных и других полевых исследований, лабораторных анализов, картографирования;

-работы по снятию, транспортировке, селективной выемке, складированию, плодородного слоя почвы;

-планировку (выравнивание) поверхности, выполаживание, террасирование откосов, отвалов и бортов карьеров;

-нанесение на рекультивируемые земли потенциально плодородных пород и плодородного слоя;

-ликвидацию послепосадочных явлений;

-очистку рекультивируемой территории от производственных отходов;

-внесение химического мелиоранта, органических и минеральных удобрений, бактериального препарата;

-предпосевную подготовку почвы, посев семян фитомелиоративных растений;

другие работы, предусмотренные проектом рекультивации, в зависимости от характера нарушения земель и дальнейшего использования рекультивированных участков.