Культивирование вирусов

Содержание 
 

Введение 

1.Виды культур  клеток. 

2.Питательные  среды 

3.Получение клеточных  культур 

3.1.Приготовление  первичных клеточных культур 

3.2.Получение  монослойных перевиваемых культур  клеток 

3.3.Роллерное  культивирование клеток 

3.4.Суспензионное культивирование клеток 

3.5.Культивирование  клеток на микроносителях 

3.6.Культивирование  вирусов на куриных эмбрионах 

3.7.Культивирование  вирусов на лабораторных животных 

Список литературы 
 
 
 
 
 
 

Введение 

Для количественного  накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур.

Большая заслуга  в деле paзработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их «бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и в жидкой перемешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и успехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня.

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением  особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

1. Виды культуры  клеток  

Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочисленных структурных элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под контроля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особенностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.

Живущие вне  организма клетки или ткани характеризуются  целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo.

В зависимости  от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования  различают несколько видов переживающих и растущих культур тканей и клеток. Наибольшее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологической практики.

Различают два  основных вида однослойных клеточных  культур: первичные и перевиваемые.

Термином «первичная»  обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Лишь отдельные  клетки или группы клеток популяции  на фоне дегенерации большей части  клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.

Различают линии  и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным  бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином — полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и других клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.

Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных и перевиваемых клеток.  

2. Питательные среды 

В любой клеточной  культуре различают клеточную и  жидкую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность клеток культуры и представляет собой питательные среды различного состава и свойств.

Все среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных элементов в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вирусных агентов.

Ростовые и  поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут входить как  естественные продукты (амниотические  жидкости, сыворотки животных), так и субстраты, полученные в результате частичной обработки естественных продуктов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические химически чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).

В качестве примера  питательной среды, полностью состоящей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян. В эту среду входит коровья амниотиче-ская жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и коровий эмбриональный экстракт (5%).

Все естественные продукты малостандартны, их использование связано с большой опасностью микробной и вирусной контаминации клеточных культур. В связи с этим и происходит постепенное вытеснение их синтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные количества солей, аминокислот и витаминов.

Независимо от назначения все питательные среды для тканевых культур конструируются на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора с достаточной буферной емкостью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и Эрла. Эти   растворы — обязательный компонент любой питательной среды. Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5—10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит.

Включение сыворотки  в то же время препятствует созданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных исследований по клеточной физиологии, так как вместе с сывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьирующих в зависимости от серии сыворотки.

В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессывороточные среды точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлением сывороток. В  связи с этим  представляет интерес работа Birch  и Pirt,  показавших,  что для  обеспечения  интенсивного  роста клеток в бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС1₂.

В ростовые питательные  среды, а так же в буферный раствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500 мл среды. 

3.Получение  клеточных культур

3.1.Приготовление  первичных клеточных  культур  

Первичной - называется культура, полученная из ткани и выращиваемая in vitro до начала субкультивирования, то есть до первого посева. Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в исходной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro. В процессе культивирования клеток происходит относительное обеднение культуры неделящимися или медленно делящимися клетками.

На первом этапе  получения первичной культуры проводят стерильное удаление фрагмента ткани, органа животного и его механическую или ферментативную дезагрегацию. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 - 3 мм, кусочки ткани отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками. Для дезагрегации ткани используют трипсин (0,25% неочищенный или 0,01 - 0,05% очищенный) или коллагеназу (200 - 2000 ед/мл, неочищенная) и другие протеолитические ферменты. Такой способ получения культуры обеспечивает высокий выход клеток.

Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности или наличию насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов. Клетки,  мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, мигрирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью версена и трипсина, а остающиеся эксплантаты будут образовывать новые выросты.

Известны такие  первичные культуры, как культура фибробластов куриного эмбриона, культура клеток почки теленка, лейкоциты. 

3.2.Получение  монослойных перевиваемых  культур клеток  

Как уже отмечалось выше, одним из методов получения  перевиваемых клеточных линий является отбор клеток с повышенной активностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизированной клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным монослоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленную для систематической смены ростовую среду разливают по небольшим сосудам (чтобы исключить бактериальное загрязнение) и хранят при t - 4°.

Смену среды  производят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростовой среды, в течение следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позднее проводят полную смену среды. Свежую среду непосредственно перед работой подогревают до t - 37°.

По мере смены сред клетки меняют свою морфологию. Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягивается к центру, и монослой приобретает звездчатый вид. Сами клетки при этом несколько удлиняются. Через 7 - 10 смен среды в матрасах, как правило, начинают появляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию.

Известны такие  первичные культуры, как культура клеток почки золотистого хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).  
 

3.3.Роллерное  культивирование  клеток  

До недавнего  времени тканевые культуры применялись в вирусологии преимущественно в виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях этот метод выращивания клеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудностей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов. С этой точки зрения, более выгодны роллерные культуры, которые экономичны, характеризуются оптимальным отношением полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы.