Культивирование вирусов

Термин «роллерные культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов и периодически омывается питательной средой. В силу определенных причин некоторое количество клеток может в отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерно-суспензионной. "Урожайность" клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки.

Более эффективным  оказалось вращение сосудов, в которых  происходило размножение клеток. Вначале клетки выращивали в пробирках, но с развитием технического оснащения возросли объемы культуральных сосудов, и от выращивания клеток во вращающихся пробирках исследователи перешли к вращающимся бутылям. Роллерные культуры стали применяться как для накопления клеток, так и размножения вирусов.

Для роллерного культивирования используются специальные  стеллажно-ярусные аппараты для  вращения бутылей или барабаны. Чаще всего для культивирования используют 0,5—3-литровые бутыли. В производственных условиях объем их может достигать 20 литров и более. Аппараты для роллерного культивирования просты, надежны и обслуживание их несложно. Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения бутылей варьировали от 8—12 об/час, до 1 об/мин. Наиболее пригодной для различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в пределах 0,5—1 об/мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. после засева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5—1,0 об/мин) для равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкую скорость вращения (20—30 об/час). 
 
 

3.4.Суспензионное  культивирование  клеток  

В 1953 году Оуенс  с сотрудниками впервые показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспендированном состоянии. С тех пор метод суспензионного культивирования привлекает внимание исследователей в связи с его высокой эффективностью при накоплении больших количеств клеток. Оказалось, что клетки перевиваемых линий, в отличие от остальных типов клеточных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь к стенкам культурального сосуда, находясь в суспензионном состоянии, благодаря постоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются, имеют более высокий «урожай», чем в стационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии клеток имеют неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидные и анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоидных линий, адаптируются быстрее к росту в суспензии.

Суспензионные культуры готовят из однослойных  культур. Клетки отслаивают от стекла с помощью растворов версена и трипсина. Осадок клеток после центрифугирования (1000 об/мин.) ресуспендируют в свежей питательной среде. Приготовленную суспензию помещают в культуральные сосуды (реакторы, ферментеры) и выращивают при постоянном перемешивании. В научных исследованиях концентрация клеток в исходной суспензии колеблется от 0,3 до 10х10 в 1 мл. Оптимальная концентрация клеток в исходной суспензии должна быть 2-5х10 в 1 мл. По мнению Эрла и его сотрудников, концентрация клеток в суспензированной культуре должна быть такой, чтобы фаза логарифмического роста наступала не позднее 16-24 часов после приготовления культуры. Суспензионные клеточные культуры проходят характерные стадии: лаг-фазу, фазу логарифмического роста, стационарную фазу и фазу логарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй стадии популяция клеток увеличивается (логарифмическая стадия роста), в третьей стадии увеличения количества клеток не наблюдается (стационарная фаза). Если культивирование продолжить дальше, то обнаружится период уменьшения численности клеток-фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения). Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста выражают временем генерации. Под временем генерации имеется в виду период, необходимый для удвоения популяции клеток в культуре. Для суспензионного выращивания клеток важным условием является перемешивание жидкости, которое должно быть непрерывным и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же время не вызывать их механического повреждения.

Максимальный  рост клеток в суспензии наблюдают  при рН 7,0-7,2. Питательные среды, применяемые  для выращивания клеток в суспензии, не отличаются от сред, используемых для  выращивания клеточных линий  в однослойной культуре. Чаще всего  при культивировании клеток в суспензиях берут среду Игла с двукратной концентрацией аминокислот и витаминов.

Таким образом, размножение клеток в суспензии  зависит от концентрации клеток в исходной суспензии, аэрации и рН среды, состава питательной среды, способа перемешивания, объема суспензии и других факторов.

Однородность  суспензии, возможность длительного  поддержания клеток в логарифмической  фазе роста, перспективы математического  моделирования процессов клеточного роста в зависимости от влияния факторов внешней среды, удобство многократного исследования физиологического состояния культуры клеток в суспензии, высокая экономичность метода -вот далеко не полный перечень преимуществ суспензионных культур.

Суспензионные культуры широко используется в вирусологических исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов. 

3.5.Культивирование  клеток на микроносителях  

В 1967 г. Van Werel предложил  метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160—230 мм может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до 50 см²/мл.

Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются  к поверхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной частице.

Основными преимуществами этого метода являются:

1) создание равномерных  условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р0₂ и др.); 2) получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл; 3) культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток; 4) введение постоянного контроля за динамикой роста клеток; 5) снижение роста контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-ного сосуда; 6) значительная экономии питательных сред; 7) возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах; 8) возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками; 9) возможность пассирования культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций микроносителя.

Микроносители должны иметь:

- небольшой положительный  заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г. В  связи с тем, что большинство  клеток животных имеют слабо  отрицательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН:

- плотность 1,05—1,15 г/см; указанная плотность является оптимальной для поддержания МН во взвешенном состоянии;

- диаметр частиц  от 100 до 250 мкм, что обеспечивает  площади для роста нескольких  сотен клеток;

- гладкую поверхность;

- прозрачность;

- отсутствие  токсичности компонентов для  клеток;

- незначительное  впитывание компонентов среды;

- универсальность,  обеспечивающую возможность использования  их для первичных, диплоидных  и гетероплоидных клеток. Немаловажное  значение имеют свойства МН, которые  позволяют использовать их многократно.

Проведено исследование многих гранулированных препаратов различной химической природы, в том числе из поперечно-сшитого (ПС) декстрана, ПС-агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, пористого селикагеля, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью использования их как микроносителей.

Пригодными являются только некоторые из них, главным  образом имеющие в своей основе ПС-декстран.

Культивирование клеток на микроносителях проводят в  обычных ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не должно быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.

Для контроля за окружающими культуру условиями  такими, как рН и О₂, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания суспензии с носителем должна быть 40-60 об/мин. Для выращивания на МН применяются различные типы клеток.

Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная среда. Правильный подбор питательной среды также  будет способствовать оптимизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян (Vero) на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ (посадочная концентрация клеток 10⁵ мл) но сравнению со средой ВМЕ и 199. Если же количество клеток при посадке снизить до 10⁴, то лучшие результаты дает среда 199. Все испытуемые среды содержали 10% фетальной сыворотки. 

Культивирование вирусов на курином эмбрионе. 

(КЭ) - куриный  зародыш, находящийся на разных  стадиях эмбрионального развития. В микробиологической практике  используют для выделения, культивирования  и идентификации вирусов, риккетсий  и иногда бактерий. Для лабораторных  целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 -37,5 °С, относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или иссл. к-ру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже к-ру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрывают. Для этого после обработки спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорионаллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта. 

Культивирование вирусов на лабораторных животных 

Вирусы культивируют на биологических моделях - в организме лабораторных животных. Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вирусов, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет имеющегося на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено.

Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки). 
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  литературы  

1.Адамс Р.  Методы культуры клеток для  биохимиков. - М.: Мир, 1983, 263 с. 

2.Вирусология.  Методы. / Под ред. Б. Мейхи. - М.: Мир, 1988, 344 с. 

3.Голубев Д.  Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976, 224 с. 

4.Дьяконов Л.  П., Глухов В. Ф., Поздняков А.  А., Денисенко Г. Ф., Калмыкова Т.  П. Культивирование клеток и  тканей животных. - Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988, 2 часть, 91 с. 

5.Животная клетка  в культуре  под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И. Ситькова. – М.: 2000 

6.Культура животных  клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. - М.: Мир, 1989, 333 с.