Молекулярные механизмы старения

 Большой интерес представляют данные о возрастных изменениях репарации различных типов повреждений ДНК. В исследованиях А. И. Газиева и др. (1981) было показано, что в клетках старых (18-22 мес.) мышей линии А/Не и СЗН/Sn уровень неингибированного оксимочевиной синтеза (репаративный синтез) в 2 раза ниже, чем у молодых (1.5-2 мес.). При облучении мышей разного возраста репаративный синтез увеличивается в 2-3 раза по сравнению с контролем. Авторы установили, что дело не в снижении активности ферментов репарации ДНК, поврежденной радиацией, а в степени доступности для ферментов этих повреждений ДНК в составе хроматина клеток. Об этом же свидетельствует и возрастное снижение релаксируемости нуклеоида ядер печени мышей при сравнении молодых и старых -облученных животных (Газиев и др., 1981). При амплификации фрагментов транскрибируемых (-актин, р53) и нетранскрибируемых (тяжелой цепи иммуноглобулина IgE) генов в ДНК мозга и селезенки у-облученных и необлученных крыс в возрасте 2 и 28 месяцев, было установлено, что степень амплификации фрагментов этих генов в ДНК старых крыс была существенно ниже, чем у молодых крыс. Репарация повреждений ДНК в мозге крыс разного возраста не отличалась в течение 30 мин после облучения (быстрая фаза репарации), но была существенно замедлена в последующие 5 ч (медленная фаза репарации) в мозге старых крыс (Ploskonosova et al., 1999).

 Было показано, что радиационная повреждаемость ДНК стволовых клеток кишечного эпителия мышей разных линий и возраста примерно одинакова, однако скорость репарации этих повреждений с возрастом снижается. Способность диплоидных фибробластов человека к репарации индуцированных -излучением однонитевых разрывов ДНК достоверно снижается с увеличением возраста донора (Anisimov, 1987). В ряде работ оценивалось влияние возраста донора на интенсивность внепланового синтеза ДНК в клетках человека, подвергнутых in vitro УФ-облучению. В. Lambert et a). (1979) нашли отрицательную корреляцию между возрастом и величиной внепланового синтеза ДНК (ВСД) в лейкоцитах периферической крови 58 здоровых субъектов 13-94 лет. Авторы отметили сильные индивидуальные колебания величины ВСД Было обнаружено также ослабление индуцированного УФ-светом репаративного синтеза в лимфоцитах человека с возрастом и в глубокой старости. Было установлено, что с возрастом донора существенно увеличивается накопление разрывов в ДНК фибробластов человека при кратковременном воздействии низкочастотного электромагнитного поля (50 Гц, 1 мТ), что свидетельствует о возрастном снижении эффективности репарации ДНК, поврежденной этим воздействием (Ivancsits et aL, 2003). В табл. 15 суммированы данные о влиянии возраста на эффективность репарации ДНК при различных типах повреждений. Можно видеть, что репарация ДНК зависит как от вида животных, типа повреждающего агента и вызываемого им повреждения, так и от ткани мишени.

 Большинство повреждений ДНК репарируется, но не все. Так, у крыс происходит 105 окислительных повреждений ДНК в день в расчете на клетку. Когда скорость репарации не достигает скорости индукции повреждений, происходит увеличение спонтанных повреждений ДНК с возрастом (Vijg, 2000). Точная оценка способности организма восстанавливать специфические повреждения затруднена и часто бывает ошибочной, В большинстве исследований возможного снижения репаративной активности ДНК с возрастом были использованы способы, с помощью которых оценивается фаза синтеза ДНК при эксцизионной репарации. Главный вывод из этих работ, выполненных преимущественно на культуре клеток, состоит в том, что эффективность репаративных систем ДНК не снижается с возрастом (Likhachev, 1990). Однако нельзя исключить, что при старении репарационные системы ДНК становятся более подвержены ошибкам, приводящим к усилению индукции мутаций (Anisimov et al., 1993; Vijg, 2000). В любом случае определенная степень несовершенства является главной чертой системы репарации ДНК, на что указывало фактическое накопление как повреждений ДНК, так и изменение последовательности ДНК.

 Изменения структуры и функции  генов при старении

 При старении может изменяться не только структура генов, но и направление  их функционирования. С возрастом  в соматических клетках накапливаются не только мутации, но и хромосомные перестройки (Vijg. 2000; Vijg, Dolle, 2002). Полагают, что изменения хроматина могут играть главную роль в связанных с возрастом изменениях регуляции экспрессии генов (Medvedev, 1984). С увеличением возраста не отмечено изменений стехиометрии большинства гистонов, однако имеются сообщения ой изменениях подвида гистона H1 (Medvedev, 1984). Ацетилирование гистонов, которое предположительно изменяет взаимодействие гистон-ДНК и делает ДНК белее доступной, снижается по мере старения на 30-70 %. Важную роль в увеличении продолжительности жизни, как это показано в опытах на дрожжах и С. elegans, играют деацетилазы гистонов, в частности SIR2 и RPD3 (Chang, Min, 2002).

 В последние  годы было опубликовано несколько обзорных работ, в которых обсуждается влияние возраста на транскрипцию и трансляцию. Установлено, что в целом транскрипционная активность клетки при старении организма снижается. Однако уровень общей РНК остается постоянным за счет снижения скорости обновления РНК. В большинстве исследований была найдена хорошая корреляция между связанными с возрастом изменениями уровней видов мРНК и уровнем белка (или энзиматической активностью), обусловленным различными видами мРНК. Это было показано на печени крыс в отношении альбумина, альфа(2)-глобулина и супероксиддисмутазы и каталазы. Связанное с возрастом уменьшение индукции митогенами мРНК интерлейкина 2 (ИЛ-2) в лимфоцитах грызунов и человека соответствует возрастному снижению биологической активности этих двух интерлейкинов (Roy et al., 2002).

 Роль  окислительного стресса  в старении  

 Ваша  теория и солидна, и остроумна.

 Впрочем, вcе теории стоят одна другой.

 Воланд 

 (А.  Булгаков. Мастер и Маргарита) 

 Одной из наиболее плодотворно развивающихся  в последние годы фундаментальных теорий является свободнорадикальная теория старения, практически одновременно выдвинутая в 1956 г. D. Harman (Harman, 1994) и в 1958 г. Н. М Эмануэлем (Эмануэль, 1975; Emanuel, 1985) (рис. 5, 6). Эта теория объясняет не только механизм старения, но и широкий круг связанных с ним патологических процессов (сердечно-сосудистые заболевания, возрастные иммунодепрессия и дисфункция мозга, катаракта, рак и некоторые другие).

 Согласно  этой теории, продуцируемые главным  образом в митохондриях клеток молекулы супероксида (О-2), Н2О2, гидроксильного радикала (НО) и, возможно, синглетного кислорода (О2) повреждают клеточные макромолекулы (ДНК, белки, липиды) (Cutler, 1991; Harman, 1994; Barja, 2002). Полагают, что активные формы кислорода вызывают повреждения мембран, коллагена, ДНК, хроматина, структурных белков и участвуют в регуляции внутриклеточного уровня кальция и т. д. (Гусев, Панченко, 1997; Papa, Skulachev, 1997; Кольтовер, 1998; Skulachev, 1999, 2001; Barja, 2002). Подсчитано, что за 70 лет жизни человека организм производит около 1 т радикалов кислорода, хотя только 2-5 % вдыхаемого с воздухом кислорода превращается в его токсические радикалы. В клетке крысы может возникать до 104 вызванных активными формами кислорода повреждений ДНК в день {Ames ct al., 1993) и при постоянных условиях до 10 % молекул белка могут иметь карбонильные модификации. Подавляющее большинство из них нейтрализуется еще до того, как успеют повредить те или иные компоненты клетки. Так, из каждого миллиона образующихся супероксидных радикалов от ферментной защиты ускользает не более четырех. К основным эндогенным факторам антиоксидантной защиты организма относятся некоторые ферменты и витамины (табл. 16). 

 Показано, что видовая продолжительность  жизни прямо коррелирует с  активностью супероксиддисмутазы (СОД), содержанием -каротина, -токоферола и мочевой кислоты в сыворотке крови (Cutler, 1991). Более того, у долгоживущих линий D. melanogaster экспрессия СОД, каталазы, глютатионредуктазы и ксантиндегидрогеназы была достоверно большей, чем у короткоживущих линий мух (Arkind et al., 1996). Выявлена положительная корреляция между продолжительностью жизни млекопитающих и резистентностью их клеток к окислительному стрессу, вызываемому различными агентами (Kapahi et al., 1999).

 Установлена высокая корреляция между активностью основного обмена, активностью СОД и максимальной продолжительностью жизни у животных 14 видов, включая человека. В этой связи интересно наблюдение, что при повышении температуры происходит усиление образования 8-оксигуанина в ДНК, что свидетельствует о том, что нагревание может усиливать окислительный стресс, повышая уровень активных форм кислорода (Bruskov et al., 2002). Выявлено существенное накопление с возрастом продуктов окислительного повреждения белков свободными радикалами, генерируемыми нейтрофилами (Pleshakova et al., 1998; Плешакова и др., 2000). Однако при лонгитудинальном исследовании экскреции с мочой продуктов окислительного повреждения ДНК 8-оксигуанина (8-ОНГ) и его дезоксирибуноклеозида (8-ОНдГ) у мышей и крыс обнаружено снижение их величины с возрастом (Обухова и др., 1997), что может отражать снижение эффективности их репарации, поскольку при этом увеличивается их содержание в ДНК печени, почек и желудка (Ames, 1989). У крыс OXYS с ускоренным старением выявлены дисфункция митохондрий и нарушения поведения, свойственные нейродегенеративным заболеваниям (Колосова и др., 2001).

 Было  установлено, что с возрастом  происходит снижение общей антиокислительной  и антирадикальной активности крови  у людей (Anisimov et al., 2001). У людей старческого возраста (83-85 лет) и долгожителей (90-105 лет) выявлено повышение уровня продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в липопротсинах низкой плотности (ЛНП) и сниженной устойчивостью ЛНК к окислению по сравнению со здоровыми людьми в возрасте 36-59 лет (Шабалин и др., 2002).

 В пользу свободнорадикальной теории старения говорят эксперименты, в которых  трансгенные линии D. melanogaster с дополнительными копиями генов, обеспечивающих избыточную активность СОД и каталазы, жили на 20-37 % дольше контрольных мух, тогда как мухи с избыточными копиями генов лишь одного из этих ферментов антиокислительной защиты таким эффектом не обладали (Оrr, Sohal, 1994), Трансгенные дрозофилы с избыточной экспрессией гена SOD1 в мотонейронах жили на 40 % дольше и были значительно устойчивее к окислительному стрессу, чем мухи, не имевшие этого гена (Parkes et al., 1998). Витамин Е, мелатонин, хелатные агенты и некоторые синтетические антиоксиданты увеличивали продолжительность жизни не только дрозофил, но и лабораторных мышей и крыс (Обухова, Эмануэль, 1983; Harman, 1994; Rciter, 1995; Газиев и др., 1997; Anisimov et al., 2001) (см. главу 9). На модели экспериментальной мозговой ишемии установлено, что применение карнозина существенно уменьшает смертность и улучшает функцию мозга у крыс. При ишемии сердца карнозин защищает кардиомиоциты от повреждения и улучшает сократимость сердечной мышцы. В механизме защитного действия карнозина важную роль играют его антиоксидантная активность, способность защищать мембраны, образовывать комплексы с переходными металлами и регулировать функцию макрофагов (Болдырев, 1998).

 У гомозиготных мышей, с выключенным геном Prdx1, кодирующим небольшие антиокислительные белки пероксиредоксины, содержащие каталитические остатки цистеина и использующие тиоредоксин как донор электронов, было отмечено существенное укорочение продолжительности жизни по сравнению с контролем дикого типа, сопровождавшееся увеличением частоты развития новообразований (Neumann et ai., 2003). Поскольку частота опухолей увеличивалась также и у гетерозиготов Prdx1+/- авторы полагают, что этот ген может являться антионкогеном. В этой же работе было показано, что эмбриональные фибробласты мышей Prdx1-/- имеют сниженный пролиферативный потенциал in vitro и повышенную чувствительность к окислительному повреждению ДНК.

 Однако  то обстоятельство, что продукты взаимодействия АФК с макромолекулами постоянно  обнаруживаются в органах и тканях организма, свидетельствует о том, что системы антиоксидантной  защиты недостаточно эффективны и что клетки постоянно подвергаются окислительному стрессу. Противодействие ему может играть существенную роль в механизме геропротекторного действия эндогенных и экзогенных антиоксидантов (см. главу 9).

 В последние  годы получила развитие так называемая митохондриальная теория старения, в основе которой лежат два предположения (Linnane et al., 1989):

 Во-первых, предполагается, что мутации митохондриальной ДНК (мтДНК) накапливаются с возрастом  и могут достигать значительной частоты. Однако само по себе это предположение не может объяснить роль мтДНК в старении, поскольку каждая клетка содержит несколько митохондриальных геномов. Случайный мутагенез будет приводить к формированию смеси различных типов мутантных и дикого типа молекул. Необходим специальный механизм, который сможет обеспечить создание достаточно высокой концентрации фенотипически значимых мутантов, способных преодолеть фенотипический порог (Khrapko et ab, 2003; Kraytsberg etal., 2003).

 Во-вторых, предполагается, что мутации мтДНК распределяются таким образом, что каждая клетка содержит одну мутацию или главным образом один тип мутаций. При этом мутация может полностью реализовать свою потенциальную возможность нарушить физиологию клетки и тем самым быть активно вовлеченной в процесс старения. Хотя прямых доказательств того, что мутации в мтДНК вызывают значимые для старения эффекты, еще мало (за исключением, пожалуй, саркопении), исследования самого последнего времени полностью подтвердили оба упомянутых предположения, тем самым укрепив митохондриально-мутационную теорию старения (de Grey, 2002; Kraytsberg et al., 2003). При экстраполяции кривой экспоненциального накопления повреждений мтДНК (как точечных мугаций, так и делеций) до уровня 100 % в клетках сердца человека дает оценку 129 лет. Повреждения мтДК приводят к нарушению дыхания митохондрий, что увеличивает образование АФК и соответственно новым повреждениям мтДНК.