Получение чистых культур микроорганизмов в производственных условиях. Принципы определения вида бактерий

          ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА  №5.

Получение чистых культур микроорганизмов  в производственных

условиях. Принципы определения вида бактерий 

      Цель: Ознакомить студентов с понятием «чистая культура» и способами ее получения в производственных условиях, а также принципами, положенными в основу  определения вида бактерий.  

 Задания:

     Таблица 1 – Результаты исследований

 
 

     Контрольные вопросы: 

1. Что называется чистой культурой микроорганизмов?

      Чистой  культурой микроорганизмов называется культура одного вида, полученная из одной  споры или одной клетки. Выделение  микроорганизмов в виде чистых культур, свободных от примесей других видов  микробов, необходимо при изучении их свойств и определения видового названия. 

2. Каково  назначение чистых культур микроорганизмов?

В естественных условиях различные объекты (вода, пищевые  продукты, почва) содержат, как правило, смешанную микрофлору. Поэтому при  изучении состава микрофлоры того или  иного объекта бактериологическое исследование обычно начинают с выделения микроорганизмов в виде чистых культур. Чистые культуры бактерий необходимы также для некоторых производственных процессов. Так, применение при получении кисломолочных продуктов, квашении овощей, хлебного кваса микроорганизмов с известными свойствами без примесей посторонних видов позволяет улучшить качество продукции и экономические показатели производства. 

3. Какими  способами можно получить чистую культуру микроорганизмов?

      Существует  ряд методов получения чистых культур микроорганизмов. Наиболее распространенными способами получения  чистых культур в производственных условиях являются методы истощающего  посева, основанные на механическом разделении клеток и выращивании их потомства  в виде изолированных колоний:

     5.2.1 истощающий посев газоном;

     5.2.2 истощающий посев штрихом по  секторам;

     5.2.3 истощающий посев розливкой. 

5.2.1 Истощающий   посев   газоном 

      Посев производится на трех пронумерованных  чашках Петри (1,2,3) с питательной  средой. Посев производится простерилизованным в пламени спиртовки и охлажденным стеклянным шпателем Дригальского.

      На  поверхность питательной среды  в чашке 1 наносят петлей или стерильной пастеровской пипеткой каплю исследуемого материала и растирают ее стерильным шпателем, двигая его сначала взад и вперед на небольшом участке, а  затем круговыми движениями  по всей питательной среде. При этом чашку приоткрывают левой рукой  настолько, чтобы в щель мог пройти только лишь шпатель.

      Вынимают  шпатель из чашки 1, закрывают ее и быстро переносят шпатель в  чашку 2, не прожигая его. Растирают  материал по всей поверхности среды, прикасаясь к ней той же стороной шпателя, которой растирался материал в чашке 1. Чашку 2 закрывают.

      Затем  переносят шпатель в чашку 3 и  растирают материал по поверхности  среды. Закрывают чашку, шпатель  прожигают или опускают в дезинфицирующий  раствор. Чашки подписывают и  ставят в термостат вверх дном. Через сутки на чашке 1, где было много материала, получается сплошной рост бактерий, и отдельных колоний  нет. На чашке 2 и, в особенности на чашке 3, колонии распределились изолированно. Поэтому они легко доступны исследователю. 

5.2.2 Истощающий  посев штрихом по секторам

      Соблюдая  правила стерильности, разливают  питательную среду в чашки  Петри. Затем дают среде остыть, слегка подсушивают ее в термостате. Затем чашку переворачивают вверх дном и расчерчивают карандашом по стеклу на четыре сектора. Чашку переворачивают крышкой вверх.

     Приоткрыв чашку Петри, на один из секторов наносят  каплю микробной взвеси, распределяют петлей на небольшой площадке, затем  делают посев штрихом поочередно в каждом секторе. Сеять нужно  осторожно, слегка прикасаясь петлей, чтобы не повредить среду. Посевы подписывают и термостатируют. Через сутки в первых секторах наблюдается сплошной рост по штриху, а в последнем секторе вырастают изолированные колонии. 

5.2.3 Истощающий   посев   розливкой

     Этот  метод получения чистых культур  был впервые предложен Робертом Кохом и поэтому иначе называется методом пластинчатых разводок Коха или методом чашечных культур  Коха.

     При выделении чистой культуры бактерий методом Коха основным условием является предварительное разведение концентрации микроорганизмов в исследуемом  материале с таким расчетом, чтобы  при посеве его на питательной  среде выросли изолированные  колонии. Этот метод употребляется  в тех случаях, когда нужно  произвести количественное определение  микроорганизмов в определенном объеме исследуемого материала (вода, молоко, пиво, зерновая болтушка и т.д.). Разведение исследуемого материала  можно производить как непосредственно  в питательной среде при посеве, так и в стерильной водопроводной  воде перед посевом.

     В первом случае берут несколько пробирок с 9 см³ МПА, расплавляют их в водяной бане, охлаждают до 50-55°С и помещают в стакан с водой, имеющий примерно такую же температуру. Стерильной пипеткой набирают 1см³ исследуемого материала, вносят в первую пробирку с МПА и перемешивают. Получается первое разведение – 10^-1 (1:10). Второй стерильной пипеткой забирают 1см³ разведения 10^-1, переносят во вторую пробирку, перемешивают, получая разведения 10^-2 (1:100) и т.д. Количество пробирок, взятых для опыта, зависит от степени загрязненности исследуемого материала. Затем полученные разведения в питательной среде выливают в чашки Петри, предварительно согретые в термостате во избежание неравномерного застывания агара. Пробирки берут по порядку, обжигают край, вливают содержимое в чашку Петри, открывая их настолько, чтобы в щель вышло лишь устье пробирки.

     Опорожненные  пробирки опускают в дезинфицирующий  раствор. Покачивая чашки, распределяют МПА равномерно по всей поверхности  дна.

     Во  втором случае проводят аналогичное  разведение исследуемого материала, но в стерильной водопроводной воде, получая разведение 10^-1, 10^-2, 10^-3 и т.д. Затем забирают отдельными стерильными пипетками из каждой пробирки по 0,1-1 см³ соответствующего разведения, вносят в стерильные чашки Петри, осторожно приподнимая их крышки, и заливают примерно 10 см³ расплавленного, но охлажденного до 45°С МПА. Легким покачиванием чашки среду равномерно распределяют по дну и дают ей застыть. Затем чашки переворачивают вверх дном, подписывают и ставят в термостат для выращивания микроорганизмов. 

4. Как определяется вид бактерий?

     Определение вида бактерий является весьма сложной  задачей. Видовое название выделенных чистых культур бактерий устанавливают  путем изучения их культуральных, морфологических и физиологических свойств. По совокупности изученных признаков определяют таксономическое положение (положение в систематике) микроорганизмов, пользуясь специальными определителями. 

     

5. Какие культуральные, морфологические и физиологические признаки  используются для определения вида бактерий?

   5.3.1 Культуральные признаки

   Культуральные признаки бактерий характеризуются особенностью роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.

   На  плотных питательных средах изучаются  признаки изолированно от других выросших в чашке Петри колоний бактерий. В зависимости от их положения  в среде различают поверхностные  и глубинные колонии. Наиболее типично  видовые признаки выражены у поверхностных  колоний. К культуральным признакам относятся (рис. 5):

   а) форма колоний – округлая, неправильная, амебовидная, ризоидная, мицелиальная.

   б) размер колонии – точечные, мелкие, средние, крупные.

   в) край колонии – ровный, волнистый, лопастной, бахромчатый.

   г) структура колонии – однородная, мелкозернистая, крупнозернистая, струйчатая, волнистая.

   д) профиль колонии – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный.

   е) консистенция колонии – мягкая, слизистая, тягучая, хрупкая. 

   При этом форму, профиль, цвет, блеск определяют невооруженным глазом; край и структуру  – при малом увеличении микроскопа; консистенцию – прикосновением к  ее поверхности петлей; размеры –  обычной линейкой (колонии точечные менее 1мм в диаметре, мелкие 1-2, средние  – 3-4, крупные – более 4мм). 
 

   На  жидких питательных средах отмечают характер распределения культуры в  жидкости (равномерное, вызывающее помутнение среды; придонное или поверхностное), который обусловлен отношением микроорганизмов  к кислороду воздуха. Мутность среды может быть хлопьевидной, однородной; пленка – тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, морщинистой; осадок – скудным или обильным. 

   5.3.2 Морфологические признаки

   Морфологические свойства бактерий исследуются только при микроскопировании прижизненных или фиксированных и окрашенных по Граму препаратов. При этом учитывается:

   а) форма клеток – (кокки, палочки, извитые  формы);

   б) характер соединения клеток – единичные, соединенные попарно, по четыре, в  цепочки, хаотически и др.;

   в) окраска по способу Грама (положительная, отрицательная);

   г) наличие и месторасположение  спор;

   д) подвижность – наличие и месторасположение жгутиков;

   е) капсулообразование – наличие ослизненной оболочки. 

   5.3.3 Физиологические признаки

   Физиологические свойства бактерий обусловлены особенностью обмена веществ в клетке и чаще всего изучаются путем посева их на дифференциально-диагностические питательные среды.

   Наиболее  существенными физиологическими признаками являются:

   а) отношение к кислороду воздуха (тип дыхания). Оно определяется по характеру роста в столбике МПА  при посеве уколом. После инкубации  в термостате в течение 48 часов  при температуре 30-37^оС в зависимости от типа дыхания возможны три типа роста: шляпкой на поверхности (аэробные микроорганизмы), рост из дна пробирки (строгие анаэробы) и равномерный рост по всей длине укола (факультативно-анаэробные бактерии);

   б) протеолитические свойства (способность  расщеплять белковые вещества). Их определяют по выделению из питательной среды  газов (NH₃, H₂S, индола), а также по способности разжижать желатин.

   Для улавливания газов культуру выращивают на жидкой питательной среде (МПБ, мясной воде), закрепив в пробирке полоску  фильтровальной бумажки, пропитанную  соответствующим реактивом. Выделение  аммиака обнаруживают с помощью  лакмусовой бумажки, посинение которой  свидетельствует о подщелачивании среды под влиянием NH₃, выделение сероводорода – с помощью фильтровальной бумажки, пропитанной уксуснокислым свинцом, чернеющей в результате образования сернистого цинка (ZnS), выделение индола – с помощью бумажки, пропитанной щавелевой кислотой и краснеющей в результате образования соединения с индолом.