Рентгеновская структурная кристаллография белков и вирусов

1. Рентгеновская структурная кристаллография белков и вирусов

 

А.  Принципы метода peнтгенострутурного анализа

 

Чтобы легче понять принципы этого метода, рассмотрим пример хорошо известный в оптике [24]. Допустим, что у нас имеется опттическая система, состоящая из точечного источника света и конденсора, преобразующего расходящийся световой пучок в параллельный. На пути этого пучка поставим непрозрачный экран (L) с малым отверстием произвольной формы (рис. 1). Свет будет дифрагировать на этом отверстии. Поставив выпуклую линзу, проследим, как формируется оптическое изображение светящегося объекта (данном случае отверстия). В фокальной плоскости линзы (L 1 ) соберутся параллельные лучи и будет наблюдаться так называемое дифракционное, или первичное, изображение объекта (в данном случае дифракция Фраунгофера). Истинное или вторичное изображение объекта будет наблююдаться не в фокальной, а в другой плоскости (L 2 ), находящейся на определенном расстоянии от фокуса линзы и сопряженной с плоскостью объекта.

Дифракционная картина объекта в фокальной плоскости линзы может быть рассчитана теоретичски при помощи формул, известных в математике как трансформация Фурье.

Производя трансформацию Фурье, мы по существу расчитываем интерференцию всех дифрагированных световых волн, пришедших в определенную точку фокальной плоскости. К формулам Фурье-траноформации мы вернемся, когда будем pacсматривать наш метод детальнее.

Существует очень важная теорема, согласно которой трансформация Фурье, проведенная дважды, т. е. в данном случае траноформация Фурье от дифракционной картины в  фокальной плоскости, дает изображение объекта. Таким образом, в процессе формирования изображения для рассмотренной оптической системы световые лучи интерферируют по законам, соответствующим проведению двух трансформаций Фурье: первой при переходе лучей от объекта к фокальной плоскости и второй -

при переходе от фокальноЙ ,плоскости к изображению предмета. В более общем случае можно рассматривать не плоский, а трехмерный объект и применять к нему изложенные рассуждения. Подобный подход к анализу оптиически:х явлений ,составляет основу дифракционной теории микроскопа Аббе.

К сожалению, микроскоп для рентгеновских лучей сделать нельзя, так как их коэффициент преломления очень близок к единице (см. стр. 39). Можно наблюдать лишь дифракцию на объектах, сравнимых по величине с длиной волны рентгеновского

излучения, т. е. на молекулах и атомах. Однако явление дифракции рентгеновских лучей имет мнoго общего с только что рассмотренным примером из оптики. Оказывается, образование рентгеновской дифракционной картины подчиняется тем же законам, что и формирование изображения объекта в фокальной; плоокости линзы. Таким образом, мы как бы имеем первую часть paccмoтpeннoгo процесса. Но чтобы увидеть атомы,

т. е. «получить изображение объекта», необходимо иметь возможность реализовать вторую часть процесса, т. е. осуществить переход от дифракционного изображения к истинному. Никакая оптическая система здесь уже помочь не может, На помощь при

ходят замечательные свойства траноформаций Фурье, поз:воляющие расчетным путем воссоздать исходную ,структуру «по ее изображению в фокальной плоскости», т. е. по ренгенограмме. Это и составляет содержание peнтгeнocтpyктурныx исследований. Задача peнтгеноструктурного анализа состоит в том, чтобы найти пространственное расположение атомов в молекулах исследуемого вещества по eгo рентгеновской дифракционной картине.

На первый взгляд она может показаться очень простой: получили peнтгeнoгpaмму, измерили, провели расчеты по формулам Фурье и определили структуру. К сожалению, все это не так. Для вычисления траноформаций Фурье необходимо знать величины амплитуд дифрагированных лучей и их относительные фазы; только в этом случае можно правильно рассчитать интерференцию. Экопериментально измерить амплитуду дифраги-

pовaннoгo излучения никогда не удается. Приходится иметь дело не с амплитудами, а интеноивностями, так как почернение фотопленки или количество квантов, считаемых счетчиками, пропорционально интенсивности излучения, т. е. квадратам амплитуд.

Но по квадрату амплитуды луча мы не можем определить, какой вклад даст этот луч в интерференщионную сумму (трансформацию Фурье) положительный или отрицательный или, в общем случае, с какой фазой следует учитывать вклад каждого из лучей. 

Основная и принципиальная трудность метода peнтгeнocтpyктурнoгo анализа и состоит в том, что непосредственно из экопериментальных данных не удается измерить фазы дифрагированных лучей. Поэтому рентгенографическое определение структуры в каждом конкретном случае не является решением стандартной задачи, оно требует поиска метода определения фаз дифрагированных лучей. Правда, иногда обходятся другим способом ограничиваются построением гипотетической модели для искомой структуры. Хорошее совпадение теоретически рассчитанной дифракционной картины для этой модели с экспериментально наблюдаемой может служить в известной мере критерием правильности предполагаемой модели. Однако это далеко не универсальный метод, и для таких сложных объектов, как кристаллические белки, он не применим. Задача определения фаз дифрагированных рентгеновских лучей может быть решена в некоторых особых случаях, когда исследуемый объект является монокристаллом. Для кристаллов белков разработан специальный метод ее решения. В этой главе кратко изложены основы этото метода. Однако, прежде чем перейти к eгo разбору, необходимо уяснить основные особенности строения кристаллов и познакомиться с законами дифракции рентгеновских лучей в кристаллических структурах.

 

Б. Основные особенности строения кристаллов

 

Основная особенность структуры каждого кристалла состоит в том, что он построен из регулярно расположенных в пространстве отдельных групп атомов. Такими группами, или структурными единицами, кристалла мoгут быть, например, молекулы или группы молекул. Располагаясь периодически в трех измерениях, они образуют тем самым кристаллическую решетку, Регулярность структуры кристаллов проявляется в их характерной внешней форме. Трехмерную кристаллическую решетку можно представить себе как систему одинаковых элементарных параллелепипедов. Каждый такой параллелепипед носит название элементарной ячейки кристалла. Описывается элементарная ячейка при помощи трех векторов, соответствующих ее пересекающимся ребрам и задается шестью параметрами длинами этих векторов (a, b, c) и углами между ними (α, β, γ). в зависимости от соотношения длин векторов и значений yглов между ними различают сингонии кристаллов. Так, например, если длины одинаковы и углы прямые, сингония кубическая, если длины различны, но углы остаются прямыми, ,сингония pом- бическая, и т. д. Существует вceгo семь сингоний, все они lпредставлены в таблице.

Всякий кристалл это замкнутый многогранник, который может иметь определенную симметрию. Для замкнутых мнoгoгpaнников характерны следующие элементы симметрии (рис. 2):

1) цeнтp симметрии, при наличии котopoгo расположение

диаметрально противоположных ребер, граней, углов идентично;

 

2) плоскость симметрии, при наличии которой одна половина многогранника оказывается зеркальным отображением другой;

3) ось симметрии, при повороте вокpyг которой на определенный угол многогранник совмещается сам с собой. В кристаллах существуют оси симметрии различных порядков; порядок оси определяется углом поворота. Так, ось симметрии втopoгo порядка соответствует повороту на 3600/2 == 1800, тpeтьeгo на  3600/3== 1200 и т. д. Условие плотного заполнения пространства допускает в кристаллах существование лишь осей 1, 2, 3, 4, 5 и 6гo порядков.

 

 

Наличие таких  элементов симметрии обусловливает так называемые закрытые симметрические операции, которые, в конечном итоге, приводят тот или иной структурный элемент к совпадению с самим собой. Возможны 32 различные комбинации этих операций, или 32 класса симметрии. Классами симметрии определяется не только внешняя форма кристалла. В соответствии с ними располагаются атомы и молекулы в элементарных кристаллических ячейках. Для каждой сингонии существует свой набор классов симметрии. Однако перечисленными элементами симметрии не ограничивается расположение атомов и молекул в элементарных ячейках, оно может определяться и так называемыми открытыми симметрическими операциями. Эти операции уже не применимы к замкнутым фигурам, так как они не приводят структурную единицу, на которую действуют, к совпадению с самой собой. Heобходимым элементом операций является трансляция - смещение структурной единицы вдоль определенного направления. К подобным операциям приводят винтовые оси и плоскости скольжения. Винтовая ось, поворачивая структурную единицу на определенный угол, смещает ее вдоль оси на определенный отрезок. Плоскость скольжения также смещает отраженный в

плоскости элемент определенным образом (см. .рис. 2).

Существует 230 комбинаций всех элементов симметрии и различных трансляций, допустимых законами кристаллографии. Каждая такая комбинация называется пространственной группой, для каждой сингонии и класса симметрии характерен свой набор пространственных групп. Пространственные группы кристаллов впервые были охарактеризованы нашим соотечественником Е. С. Федоровым [30]. Обозначаются они специальными символами, отражающими набор элементов симметрии соответствующей группы [31],

Рентгеноструктурные исследования кристалла начинаются с определения размеров и формы элементарной ячейки и установления eгo пространственной группы симметрии. Эти сведения необходимы для дальнейших исследованиЙ, так как они в явном или неявном виде входят во все последующие расчеты.

 

В. Кристаллы белков и вирусов

 

Очень многие белки мoгут кристаллизоваться. Кристаллизуются также и более сложные соединения, например вирусы, которые представляют собой комплексы белков с нуклеиновыми кислотами. Образующиеся при этом кристаллы по многим своим

свойствам соответствуют тому, что принято называть кристаллом в классическом смысле этого понятия. Они имеют xapaктepную внешнюю oгpaнкy (рис. 3). Peнтгeнoгpaммы свидетельствуют о достаточной правильности их трехмерной кристаллической решетки (рис. 4). Кристаллизуются белки и вирусы во всех известных сингониях. Параметры их элементарных ячеек заключены в пределах от нескольких десятков до нескольких сотен aнгcрpeм (см. таблицу). Однако для кристаллов оптически, активных веществ, к которым относится большинство соединений биологической природы, возможнымiи оказываются не любые пространственные группы симметрии. Молекулы с определенной оптической конфигурацией, например L-аминокислоты, нельзя расположить в пространстве так, чтобы какая-либо одна молекула стала зеркальным отображением другой (см. рис. 2). Поэтому белки и вирусы не мoгут кристаллизоваться в тех пространственных группах, где есть зеркальные элементы симметрии, т. е. центр и плоскости симметрии. Важная отличительная особенность кристаллов белков и вирусов состоит в том, что их элементарная ячейка всегда в виде необходимого компонента содержит воду, которая может составлять от 30 до 60% веса содержимого ячейки. Помимо воды, в элементарной ячейке белковых кристаллов мoгyг находиться также ионы солей, молекулы органических растворителей, coдepжащиеся в маточном растворе, из котopoгo происходила кри- сталлизация. Все эти дополнителыные интредиенты мoгут образовывать целые слои между молекулами белка и располагаться в многочисленных пустотах элементарных ячеек, возникающих за счет тoгo, что поверхность больших макромолекул чрезвычайно нерегулярна она имеет мнoгo выступов и впадин. Эффективиое заполнеиие пространства фнгурами такой сложной формы невозможно, поэтому в сухом состоянии белковый кристалл энергетически не стабилен и по мере высыхания становится все более и более дефектным.  Как правило, кристаллизация белков и вирусов происходит при добавлении к их растворам ионов различных солей. Таблица

 

 

 

 

Высаливание один из распространенных методов кристаллизации и одновременно очистки препаратов. Уменьшение растворимости белков при добавлении к их растворам таких солей, как (NH₄)₂S0., MgSO₄, NaCl и т. д., обусловлено нарушением гидратной оболочки белковых молекул и соответственно увеличением их взаимодействия. Понизить растворимость белков можно также при помощи таких органических растворителей, как спирты, ацетои и др. Эти peaгeнгы также используются для кристаллизации. Вырашивание больших кристаллов размером в несколько десятых долей миллиметра, годных для рентгеноструктурных нсследований, задача достаточио ,сложная. Универсальных рецептов для ее решения нет. Это обстоятельство в известной мере предопределило ход развития структурной кристаллографии белков. Первыми объектами исследованнй, для которых удалось довести до конца анализ структуры, былн не наиболее интересные в биологическом отношении ферменты, а гемобелкн, которые сравнительно легко образуют большие кристаллы.

 

Г. Дифракция рентгеновских лучей иа кристаллической решетке. Закон Брегга Вульфа

 

 

Как известно, рентгеновские лучи это электромагнитные волны, которые занимают область спектра между γ-излучением и коротким ультрафиолетом. В структурных исследованиях используются лучи с длинами волн от 0,5 до 2А. (когда на образец попадает рентгеновский луч, под дейсгвием электромагнитной волны этого луча все атомы исследуемого вещества становятся иcгочниками вторичных рассеянных волн. Эти волиы Moгут ннтерферировать, так как рассеяние таких рентгеновских лучей на атомах происходит главным образом без изменения длины волны. В то же время межатомные расстояния по своей величине сравнимы с длиной волны используемого излучения. Интерференционная, или, иначе, дифракционная, картина определяется особенностями взаимного расположения атомов в исследуемом веществе. Регулярное и симметричное взаимное расположение атомов в кристаллических решетках обусловливает возникнове-

ние регулярной и симметричной дифракционной картины, состоящей из дискретных максимумов. Как показали Брегг и Вульф, все сложное явление дифракции рентгеновских лучей в кристалле можно представить как их зеркальное отражение от некоторых плоскостей, которые можно мысленно построить в кристаллической решетке. Каждому отраженному лучу принято приписывать определенные индексы, которые одновременно являются индексами отражающей плоскости и характеризуют ориентацию отражающих плоскостей в кристалле. Чтобы понять, как задается ориентация отражающих плоскостей в кристаллической решетке, разделим каждый из основных векторов элементарной ячейки на отрезки, соответствующие делению длины ребра на небольшие целые числа, и проведем через первые точки деления плоскость. Допустим, мы разделили ребро, направленное вдоль оси а, на три части, вдоль оси b на две части и вдоль оси с на четыре части. Припишем плоскости, проведенной через первые точки деления, индексы (324); они однозначно определят ее ориентацию, если известно отношение длин осевых отрезков ячейки. Выбранные таким образом индексы носят название миллеровских индексов плоскостей. Один из основных законов кристаллографии состоит в том, что внешние грани кристаллов параллельны плоскостям с небольшими миллеровскими индексами. Разделив ребра элементарной ячейки на отрезки определенной длины, мы можем провести через последовательные точки деления серию последовательных плоскостей (рис. 5). Все они окажутся параллельными друг другу и будут находиться на одинаковом одна от другой расстоянии. Такому семейству параллельных плоскостей приписывают одни и те же индексы. Чем больше индексы плоскости, тем на большее число частей разбивается каждый из осевых отрезков и тем, следовательно, меньше межплоскостное расстояние. Таким образом, для каждого семейства плоскостей с определенными индексами характерно свое межплоскостное расстояние. Межплоскостные расстояния принято обозначать d_hkl, где h, k, l - миллеровские индексы семейства плоскостей. Основной закон дифракции рентгеновских лучей в кристалле - закон Брегга Вульфа определяет зависимость угла отражения рентгеновских лучей θ от длины волны используемого излучения λ и межплоскостного расстояния d той системы плоскостей, от которой происходит отражение. Он может быть получен из простых геометрических соображений (рис. е). Для тoгo чтобы произошло усиление интенсивности, необходимо, чтобы разность хода лучей (отраженных последовательными плоскостями)