Технология использования иммобилизованных ферментов и клеток

                Федеральное агентство по образованию

     Волгоградский Государственный Технический Университет

Кафедра «Промышленная экология и безопасность жизнедеятельности»

Реферат по биотехнологии

Тема: «Технология использования иммобилизованных ферментов и клеток»

                                                                       Выполнила:

                                                                                              студентка группы хт-444

                                                                                              Проверила:

                                                                       профессор кафедры 

                                                                       ПЭБЖ                  

                                                                                               Владимцева И.В.

                                            Волгоград 2010

Содержание

Введение ……………………………………………………………….3

Понятие ферментов …………………………………………………...4

Общая характеристика иммобилизованных ферментов…….………5

Классификация носителей для ферментов …………….……………6

Методы иммобилизации ферментов …………………………………9

Иммобилизация клеток ……………………………………………...17

Применение иммобилизованных ферментов ………………………19

Применение иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности ………………………………….…………………20

Заключение ……………………………………….…………………..21

Список используемых источников …………………………………23

      Введение.

     Принципиально новые перспективы открылись перед приклад­ной энзимологией в результате создания нового типа биоорганических «катализаторов, так называемых иммобилизованных ферментов,т.е.ферментов,связанных с носителем.Нельсон и Гриффинц уже в 1916 г.показали,что инвертаза,если адсорбировать её на угле или алюмогеле,сохраняет каталитическую активность,однако целенаправленная разработка такого рода гетерогенных катализаторов на основе ферментов началась лишь в 50-х годах.

     Сам термин «иммобилизованные ферменты» узаконен сравни­тельно недавно. В принципе понятие «иммобилизация» можно понимать шире, чем просто связывание фермента с водонерастворимым носителем, а именно как любое ограничение степеней сво­боды ферментных молекул (или их, фрагментов). Этого можно до­стичь даже путем внутримолекулярной «сшивки» белковых глобул низкомолекулярными бифункциональными реагентами или же при­соединением фермента к водорастворимому полимеру. Однако та­кие препараты обычно не называют иммобилизованными; их скорее относят к ферментам, которые модифицированы соответственно «сшивающими» или полимерными реагентами.

     Иммобилизованные и модифицированные ферментные препараты, обладают рядом существенных преимуществ (при использовании в прикладных целях) по сравнению с их «нативными» предшественниками.

      Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что позволяет: 1) остановить реакцию; 2) использовать катализатор повторно; 3) получать продукт, не загрязнен­ный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых или фармацевтических производств.

     Во-вторых, гетерогенные катализаторы позволяют проводить ферментный процесс непрерывно (например, в проточных реакто­рах) и регулировать скорость катализируемой реакции (или выход продукта) скоростью потока.

     В-третьих, иммобилизация или модификация позволяют целена­правленно изменять свойства фермента, в том числе его специфич­ность (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимость активности от рН-среды и, что особенно важно, его стабильность по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям среды.

     Именно эти три момента лежат в основе научно-техни­ческого направления, называемого часто «инженерная энзимология». Текущая задача инженерной энзимологии — это разработка (конструирование) биоорганических катализаторов с заданными свойствами на основе ферментов (в том числе с использованием лолиферментных комплексов или даже клеток, искусственно ли­шенных способности расти). Говоря о «заданных» свойствах, сле­дует понимать, что они продиктованы потребностями практики; это, например, необходимое время службы катализатора при опреде­ленных условиях реакции (что зависит от его термо- и кислотостабильности и т. п.), избирательность (специфичность) действия, производительность (каталитическая активность), иммуногенность, токсичность, геометрическая форма гетерогенного катализатора и его механические свойства и др.[1]

     Понятие ферментов.

     Ферменты (от лат. fermentum - брожение, закваска), специфические белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие роль биологических катализаторов. Через их посредство реализуется генетическая информация и осуществляются все процессы обмена веществ и энергии в живых организмах. Ферменты бывают простыми или сложными белками, в состав которых наряду с белковым компонентом (апоферментом) входит небелковая часть - кофермент.

     Эффективность действия ферментов определяется значительным снижением энергии активации катализируемой реакции в результате образования промежуточных фермент-субстратных комплексов. Присоединение субстратов происходит в активных центрах, которые обладают сходством только с определенными субстратами, чем достигается высокая специфичность (избирательность) действия ферментов.

     Одна из особенностей ферментов - способность к направленному и регулируемому действию. За счёт этого контролируется согласованность всех звеньев обмена веществ. Эта способность определяется пространственностью структурной молекулы ферментов. Она реализуется через изменение скорости действия ферментов и зависит от концентрации соответствующих субстратов и кофакторов, рH среды, температуры, а также от присутствия специфических активаторов и ингибиторов (например, адениловых нуклеотидов, карбонильных, сульфгидрильных соединений и др.). 

     Известно более 20000 различных ферментов, из которых многие выделены из живых клеток и получены в индивидуальном состоянии. Первый кристаллический фермент (уреаза) выделен американским биохимиком Д.Самнером в 1926 г. Для ряда ферментов изучена последовательность аминокислот и выяснено расположение полипептидных цепей в трёхмерном пространстве. В лабораторных условиях осуществлен искусственный химический синтез фермента рибонуклеазы. Ферменты используют для количественного определения и получения различных веществ, для модификации молекул нуклеиновых кислот методами генной инженерии, диагностики и лечения ряда заболеваний, а также в ряде технологических процессов, применяемых в лёгкой, пищевой и фармацевтической промышленностях.[2]

     Общая характеристика иммобилизованных ферментов.

     В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

     Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

     Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1—0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер.

     Ещё раз повторю,преимущества иммобилизованных ферментов перед предшественниками:

     1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

     2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

     3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

     4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру. [3]

     Классификация носителей для ферментов.

     Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и неорганических носителей. К носителям предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974):

        высокая химическая и биологическая стойкость;

        высокая химическая прочность;

        достаточная проницаемость для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

        возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран);

        легкая активация;

        высокая гидрофильность;

        невысокая стоимость.

     Классификация носителей схематично представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Классификация носителей для иммобилизованных ферментов

     Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные.

     Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные.

     Для иммобилизации ферментов наиболее широко используются природные полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров - неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость.

     Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и т.д.

     Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине.