Технология использования иммобилизованных ферментов и клеток

     Носитель может оказывать существенное влияние на кинетику действия иммобилизованного фермента. Так, необ­ходимо учитывать следующие возможности: внешних и внутренних диффузионных затруднений; стерических препятствий, особенно в  реакциях фермента с макромолекулярными субстратами; распределение субстратов, ингибиторов, ионов водорода и других эффекторов между водным раствором и матрицей (за счет электростатических или гидрофобных взаимодействий, водородных связей).

     Некоторые из этих эффектов нежелательны, и с ними приходит­ся бороться , подбирая другой носитель или условия иммобилизации. С другой стороны, например, эффекты распределения мож­но целенаправленно использовать для придания катализатору дру­гих свойств. Так, при иммобилизации на анионном полиэлектроли­те (рис. 5, кривая а) происходит концентрирование ионов гидроксония в зоне отрицательно заряженной матрицы, что вызывает сдвиг локального значения рН, характеризующего микроокружение фер­мента, в «кислую сторону» по сравнению с раствором. В итоге рН-профиль наблюдаемой каталитической активности оказывается смещенным вправо, т. е. в сторону более высоких значений рН бу­фера. При иммобилизации на катионном полиэлектролите (рис. 5, кривая б) имеет место прямо противоположная зависимость.

Рис. 3. Ковалентное присоединение фермента к полисахаридному носителю.

Рис. 4.. Сополимеризационный метод для иммобилизации фермента в полимерном геле.

Рис. 5. рН-зависимость максимальной ско­рости гидролиза бензилпенициллина пенициллинамидазой.

а - нативный фермент; комплекс фермента с по­ликатионом (б) и полианионом (в).

     Ферменты подвержены опас­ности «поедания» их микроорганизмами, почти всегда присутствующими в окружающей среде. Этого легко избежать, если фермент экранировать от них, включив его, например, в микропористый носитель. В результате связывания фермента с носителем стано­вятся невозможными (или хотя бы затрудненными) также и различного рода полимолекуляряые инактивационные процессы типа фермент-ферментного взаимодействия, такие, как агрегация или автолиз в случае протеолитических ферментов.

     Другой весьма распространенный механизм инактивации фер­ментов состоит в их денатурации при неблагоприятных усло­виях внешней среды (повышенная температура, крайние значения рН, органические растворители). Денатурационному разворачиванию ферментной молекулы удается воспрепятствовать, если ката­литически активную конформацию искусственно закрепить. Идея некоторых наиболее оправдавших себя принципов представлена на рис. 6 пространственное строение белковой молекулы становится более устойчивым при наложении на нее скобок (проводя внутри­молекулярную «сшивку» белка бифункциональными реагентами, см. рис. 6, а), в результате многоточечного ковалентного или нековалентного присоединения фермента к носителю (рис. 6, б) или при механическом включении его в «тесные» поры носителя (рис. 6, в). Таким путем денатурацию (инактивацию) белка уда­лось замедлить в сотяи, тысячи и миллионы раз (в зависимости от метода стабилизации и природы фермента). Это означает, что, фер­мент, который, например, при температуре 50°С инактивируется практически мгновенно (рис, 7), будучи стабилизованным, может «работать» при температуре 80° часами или сутками и при более низкой температуре—месяцами.

     Удалось также решить задачу как «заставить» ферменты функционировать в органических раство­рителях с малым содержанием воды. С этой целью применяют двух­фазные системы вода - несмешивающийся с водой органический растворитель. Гетерогенную реакционную среду создают обычно как микроэмульсию водного раствора фермента в органи­ческой среде или, что гораздо более удобно методически и техноло­гически, как суспензию в органическом растворителе пористых частиц (стекло, керамика и др.), пропитанных водным раствором фермента (рис. 8, а). Весьма важная разновидность подобного ро­да реакционных сред - это коллоидный раствор воды в органиче­ском растворителе . Здесь фермент, будучи включенным в обращенную мицеллу поверхностно-активного вещества (детергента, липида), функционирует в своеобразном микрореакторе, содержащем всего лишь несколько сот или тысяч молекул воды (рис. 8,6).

Рис. 6. Физико-химические принципы, позволяющие закрепить структуру ферментной, глобулы

а - внутримолекулярная «сшивка»; б - ковалентное или нековалентное присоедине­ние к носителю; в - механическое включе­ние в «тесные» поры носителя

Рис. 7. Температурная зависимость относительной каталитической актив­ности

1 - химотрипсин, иммобилизованный в по-лиакриламидном геле по сополимеризаци-опной методике (см. рис. 2); 2—свободный фермент

Рис. 8. Двухфазная система «вода - несмешивающийся с водой органический рас­творитель» с ферментом, включенным в поры носителя (а), и включение фермен­та в обращенные мицеллы поверхностно-активного вещества в органическом рас­творителе (б)[4]

     Иммобилизация клеток.

     В 70-х годах XX века появились первые публикации об иммобилизации клеток микроорганизмов, а первое промышленное применение иммобилизованных клеток было осуществлено в Японии в 1974 г. С их помощью получали аспарагиновую кислоту.

     Иммобилизованные клетки имеют ряд преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками:

        отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;

        снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;

        более высокая активность и стабильность;

        возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов;

        способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов.

     Для иммобилизации могут быть использованы клетки в различном состоянии: живые и поврежденные в различной степени. Одностадийные реакции могут осуществлять и живые, и поврежденные клетки. Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД).

     Проблема использования ферментативной активности иммобилизованных микроорганизмов имеет глубокие корни. Более 150 лет назад быстрый способ получения уксуса был основан на применении микроорганизмов, адсорбированных на древесной стружке. Методы иммобилизации клеток схожи с методами иммобилизации ферментов.

     Химический метод основан на образовании ковалентных связей с активированным носителем, на поперечной сшивке клеток за счет активных групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например, глутаровым альдегидом)

     К физическим методам относятся адсорбция и агрегация.

     Иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны, волокна основана на химических и физических взаимодействиях. Химические методы используются реже по сравнению с другими методами и малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее распространение получило включение клеток в состав гелей, мембран и волокон. При таком способе иммобилизации клетки могут сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в приповерхностных слоях гелей. Биокаталитическая активность целых иммобилизованных клеток в настоящее время может быть использована в различных отраслях науки и техники:

        при биосинтезе и трансформации таких соединений, как аминокислоты, органические кислоты, антибиотики, стероиды углеводы, углеводороды, нуклеотиды и нуклеозиды;

        в пивоварении и виноделии;

        при очистке сточных и природных вод;

        при извлечении металлов из сточных вод;

        при ассимиляции солнечной энергии;

        при изготовлении водородных солнечных элементов;

        в азотфиксации;

        в аналитических целях при изготовлении электродов.

     Наибольшее количество исследований по иммобилизации клеток микроорганизмов проведено японскими исследователями. Особые успехи были достигнуты ими в области синтеза аминокислот, органических кислот и антибиотиков. В Московском государственном университете был разработан метод получения аспарагиновой кислоты, который по эфективности не уступает японским. Клетки E.coli, включенные в армированный полиакриламидный гель, были с успехом использованы для получения аспарагиновой кислоты, период полужизни катализатора - 110 суток. Иммобилизовать можно не только клетки микроорганизмов, но и клетки растительных и животных тканей, используя их для синтеза физиологически активных соединений.

     Интересные возможность открываются и при иммобилизации клеточных органелл как активных полиферментных систем. Все это свидетельствует о перспективности развития одного из направлений биотехнологии, связанного с изучением и применением иммобилизованных клеток. [3]

     Применение иммобилизованных ферментов.

     Особенно ощутимый вклад иммобилизованные ферменты внесли в тонкий органический синтез, в анализ, в медицину, в процессы конверсии энергии, в пищевую и фармацевтическую промышленности.

     Для синтетической органической химии важно то, что в двухфазных реакционных средах фермент сохраняет каталитическую активность даже при исключительно малом содержании воды, поэтому равновесие катализируемой реакции (выход продукта) экспериментатор может регулировать в широких пределах, подбирая нужный органический растворитель. Иммобилизованные ферменты дали толчок к созданию принципиально новых методов "безреагентного" непрерывного анализа многокомпонентных систем органических (в ряде случаев и неорганических) соединений.

     В будущем важную роль в контроле окружающей среды и в клинической диагностике должны сыграть такие методы, как биолюминесцентный анализ и иммуноферментный анализ.

     В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме.

     Проблемы биоконверсии массы и энергии в настоящее время пытаются решить микробиологическим путем. Тем не менее иммобилизованные ферменты вносят ощутимый вклад в осуществление фотолиза воды и в биоэлектрокатализ.

     Заслуживает внимание и использование иммобилизованных ферментов в процессах переработки лигноцеллюлозного сырья.

     Иммобилизованные ферменты могут использоваться и как усилители слабых сигналов. На активный центр иммобилизованного фермента можно подействовать через носитель, подвергая последний ультразвуковой обработке, механическим нагрузкам или фотохимическим превращениям. Это позволяет регулировать каталитическую активность системы фермент - носитель под действием механических, ультразвуковых и световых сигналов. На этой основе были созданы механо- и звукочувствительные датчики и открыт путь к бессеребряной фотографии.

     Промышленные процессы с применением иммобилизованных ферментов внедрены прежде всего в пищевую и фармацевтическую промышленность. В пищевой промышленности с участием иммобилизованных ферментов идут процессы получения глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др.

      В медицине иммобилизованные ферменты используются также как лекарственные препараты, особенно в тех случаях, когда необходимо локальное воздействие. Возможности и перспективы использования в медицине ферментов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые на сегодняшний день, именно на этом пути медицину ждет создание новых высокоэффективных методов лечения. [3]

     Применение иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности.

     В пищевой и кондитерской промышленности ферменты применяются уже давно: многие из первых патентов ещё начала века касались производства ферментов именно для этих целей. Однако требования к этим препаратам тогда были не очень высокие — по существу, в производстве использовались не чистые ферменты, а различные вытяжки или полуразрушенные и высушенные клетки дрожжей или низших грибов. Ферменты (вернее, содержащие их препараты) использовали и в текстильной промышленности для отбеливания и обработки пряжи и хлопковых нитей. 

     Использование биологических процессов и агентов для получе­ния пищевых продуктов и улучшения их качества - древнейшая ветвь биотехнологии. Скорее, это ее корни. Примеры в этом отно­шении общеизвестны — получение молока, изготовление вин, уксу­са, пивоварение, сыроделие, хлебопечение и т. д. Во всех этих про­цессах в качестве биологических агентов выступали и продолжают выступать биологические организмы - от диких и домашних жи­вотных до микроорганизмов.

     История пищевых технологий насчитывает тысячелетия, и тем не менее совершенствование их продолжается не только неослабе­вающими, но даже возрастающими темпами. Масштабы современ­ных исследований и разработок в области традиционных техноло­гий пищевых продуктов огромны. Однако в последнее время наме­тились перспективы принципиального сдвига в технологиях получе­ния и улучшения качества, пищевых продуктов: разработки в этой области стали переходить от использования целых биологических организмов на клеточный и молекулярный уровни.

     Как известно, все живые организмы содержат большое коли­чество (сотни и тысячи) ферментов, основная функция которых со­стоит в проведении, ускорении и регуляции практически всех хими­ческих реакций, необходимых для жизнедеятельности организма. Благодаря высокой активности и специфичности некоторые ферменты уже давно нашли применение в ряде областей промыш­лености.[5]

     Заключение.

     В заключении,хотелось бы сказать,что производство и использование так называемых иммобилизованных ферментов-является важным направлением биотехнологии.

     Использование ферментов — биологических катализаторов — очень заманчивая вещь. Ведь они по многим своим свойствам, прежде всего активности и избирательности действия (специфичности), намного превосходят катализаторы химические. Ферменты обеспечивают осуществление химических реакций без высоких температур и давлений, а ускоряют их в миллионы и миллиарды раз. При этом каждый фермент катализирует только одну определённую реакцию.