Питательные среды

Питательные среды

Известно очень много питательных  сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся  их неотъемлемыми  компонентами, относительно   невелико.   Однако  качественный  диапазон   этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из млсных гидролизатов, обогащенных кро вью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения па тогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Раз личают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глкжозо-солевая питательная среда), и эм пирически подобранные питательные среды природного проис хождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизовапного бел ка).

Выбор питательной среды зависит  в значительной степени от цели эксперимента.  Герберт настойчиво высказывался  за повсеместное использование синтетических питательных сред. Од нако следует признать, что они обладают рядом практических  неудобств.  Микроорганизмы,  выравненные на таких питательных средах, обычно фенотепически отличаются от выращенных на питательных средах, естественного происхождения типа бульона (например, по составу и ло скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими  катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокисло тами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искуст венные среды, на которых они могли бы размножаться. Воз можно, что все эти неудобства со временем будут преодолены но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготов ленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

В литературе опубликованы результаты количественных ана лизов многих питательных сред природного происхождения, что  является определенным шагом на пути к их стандартизации Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количествах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исключительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как процессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.

В состав сред, применяемых для  выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азоты, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, Медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного  микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.

По характеру усвоения азота  патогенные  микроорганизмы делятся следующим образом:  одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного  переваривания   белков.   Строго  паразитические  виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка.

Источником  углерода для патогенных бактерий являются главным   образом   различные  углеводы:   сахар,   многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI. KH2PO, K2HPO4 и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном , неорганическими солями и водой.

Наряду с перечисленными органическими  и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантатеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества могут усваиваться  микробами только при определенной реакции питательной среды, так как прони цаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рн среды.

Потребность в питательных веществах  и физических условиях у различных  видов микробов неодинакова и  этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные  и жидкие питательные среды. Плотные  питательные среды готовят из; жидких посред-ством прибавления  к ним клеевых вещество агара  или желати-на. Агар-агар (по малайски - желе)—продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар растворяется при температуре 80-86°С, застудневает при 36 - 40 С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенных микробов при оптимальной для боль-шинства из них температуре на плотных средах. Желатин-вещество белковой природы животного происхождения. В теплой иоде при температуре 32-34°С он набухает и растворяется, а, при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.

Исходные   продукты  для  приготовления  питательных  сред. Для приготовления  питательных сред используют:

• Продукты животного происхождения (мясо, рыба, казеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).

• Продукты растительного происхождения (картофель и др.).

• Органические  и  неорганические соединения  определенного химического состава.

Питательные   среды,   приготовленные   из   продуктов   растительного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химическото состава, находят широкое применение в практике микробиологии. Синтетические питательные среды, составленные химических соединений, используют преимущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.

Требования, предъявляемые к питательным  средам.  Питательные среды должны:

•   Содержать необходимые  для питания микроба шггателып  вещества.

•   Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида

микроба.

• Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по

законам диффузии и осмоса.

• Обладать изотоничноегью.

Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным средам относятся элективные (Избирательные) и дифференциально-диагностические.

Элективные (избирательные) среды. Принцип  создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба,   для   культивирования   которого   они   предназназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строго значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания  одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.

Дифференциально-диагностические     питательные     среды.

Дифференциально-диагаостические    питательные    среды     используют   для   определения   видовой   принадлежности   исследуемого микроба, основываясь  на особенностях его обмена веществ.   По   своему   назначению  дифференциально-диагностические питательные  среды подразделяются следующим  образом:

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую  кровяную сывооротку и т. д.

• Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.

• Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

• Среды для определения  редуцирующей  способности  микробов

В    состав   дифференциально-диагностических   сред,    предназначенных для  выявления сяхаролитических и окислительно восстановительных     ферментов,   вводят     индикаторы   нейтральную красную, метиленовый синий, лакмусовую настойку кислый фуксин, бромтимолоный синий, йодный голубой краситель и poзоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различный значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента.  Однако индикатор не является обязательной cоставной частью сред, предназначенных для выявления фермен тов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических фер ментов в культуре определяют по разжижению желатина, нутого яичного или сывороточного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных cpeд — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромьш ленность выпускает стандартные, консервированные, сухие пи тательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.

Приготовление обычных  питательных сред. Основой для при готовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрак тивпые вещества

Посуда. Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалиро ванных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кислоты для  нейтрализации растворимой щелочи, затем тща тельнс промывают в  проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем  моют, прополаскивают и сушат. Сухие  флаконы, колбы, пробирки закрывают  ватно марлевыми пробками.

 Мясная вода.

1. 500 г свежей говядины или телятины, освобождают от костей жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки и прохладном месте или помеща-ют на 2 часа в термостат.

2. Мясную пасту отжимают через марлю, кипятят в течение 5 мин. Для свертывания белков, дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают во флаконы, стерилизуют 20-30 минут при 120° и сохраняют в темном место. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2—6,4), без белков. В мясной воде содержится небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовления обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон, который является первичным продуктом гидролиза белка и состоит из смеси альбумоз, полипептидов и аминокислот, полученных путем пептического или триптического переваривания.

На   мясокомбинатах  для   производства  сухого   пептона   исполъзуют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.

Жидкий пептон можно приготовить  в лабораторных условиях путем пептического переваривания белков.

Пептон Мартена.  Свиные желудки (не  промытые  водой)  с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную килоту в следующем соотношении: фарш из свиных желудков 250г . вода водопроводная, нагретая до 50°, 1000 мл, соляная кислота {удельный вес 1,18) 10 мл. Смесь выдерживают в термостатепри 50°. Через 24 часа пептон прогревают в автоклаве при 100° и фильтруют, фильтрат подщелачивают 10% раствором NaOH до щелочной реакции по лакмусу. После этого фильтрат разливают 11 колбы и стерилизуют при 115°С 30 минут.

Для приготовления бульона пептон Мартена смешивают с равным объемом  мясной воды, устанавливают необходимую  ре-акцию, кипятят 30 минут, фильтруют  и стерилизуют при 115° 30 минут.

Мясо можно переваривать с помощью  трипсина — перевар Хоттингера, при этом более полно используют белки мяса, которые расщепляются до пептонов, полипептидов и свободных аминокислот. При тршггическом переваривании мяса получают в Ю раз больше бульона, чем при обычном методе.

Мясной перевар Хоттингера. Мясо, освобожденное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусочками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной водой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45° жидкости, равный 8, заливают ею фарш. К полученной смеси добавляют сухой панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную железу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°.