Питательные среды

В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый  осадок, над которым находится  совершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положительную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% аминного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ).

1. В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекомендуется брать 3 части хлористого натрия и 2 части дву-замещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию среды и служит дополнительным источником фосфора.  Устанавливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.

2. Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доливают водой до первоначального объема, проверяют рН.

3. Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°.

Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для  выращивания анаэробных и других микробов. Мясо-пептонный агар (МПА).

1. К мясо-пептонному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого arap-aгapa.

2. Кипятят, помешивая до полного расплавления агара. В некоторых случаях для  просветления  среды  прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным количеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.

Агар-агар получают путем специальной  обработки морских водорослей. Он является веществом полисахаридной приро-ды, содержит незначительное количество азота и не пред-ставляет собой  питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100°С и застывает при 40—50°.

3. Проверяют   и   исправляют  реакцию  среды.   Отстаивают  и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем автоклаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.

4. Разливают  среду через  стеклянную  воронку  с  зажимом  в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 15—20 минут.

5. Из расплавленного стерильного мясо-пептоиного агара приготовляют скошенный  и  прямой  агар (агар столбиком).   В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.

В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие  питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметически закрытых банках и пакетах. Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА),имеются специальные и дифференциально-диагностические среды. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску яорошка растворяют в определенном объеме дистиллированной поды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей температуре.

Постоянство состава, стандартность  среды, простота и удобство в работе легкость транспортировки и хранения являются боль-шим преимуществом  сухих питательных сред.

Определение рН (концентрации водородных ионов) питательной среды производят колориметрическим методом. Известно, что дистиллированная вода имеет рН 7 (отрицательный логарифм числа водородных ионов). Выше идут показатели щелочной реакции, ниже 7 — показатели кислой реакции. Для определения рН по метода Михаэлиса имеются наборы стандартов от рН 5,4 до рН 8,4, индикаторы — 0,1% раствор паранитрофенола 0,3% раствор меганитрофенола и компаратор.

 

Рис. 3. Компаратор Михаэлиса. 1-вид спереди; 2-вид сзади;

Определение рН производится в компараторе (рис. 4)— специальном штативе с 6 гнездами. В этих гнездах размещают пробирки в определенном порядке. Во 2-е гнездо ставят пробирку с 2 мл испытуемой среды, 4 мл дистиллированной воды и 1 мл ин¬дикатора, рядом в 1-е и 3-е—такие же пробирки и наливают в них по 2 мл испытуемой среды и 5 мл дистиллированной воды. 5-е гнездо помещают пробирку с дистиллированной водой, в 4-и 6-е — стандарты с показателями, близкими заданной реакции Например, необходимо установить реакцию рН 7,4. В 4-е гнездо ставят стандартную пробирку с рН 7,2, а в 6-е—с рН 7,4. ЖелтоватыЙ цвет среды при описанном размещении пробирок  копенсируется тем, что между пробирками со стандартом и источником света устанавливают пробирку, в которой налита среда без индикатора. Пробирку рассматривают на свет через сиж отверстия компаратора на фоне голубой пластинки. Если в при веденном примере цвет исследуемой среды совпадает с цветом стандарта рН  7,2,   н   необходимо  приготовить  среду  с  цветом стандарта рН 7,4, то ко нторой пробирке содержащей 2 мл испытуемой среды и индикатор, микроиипеткой прибавляют N/20 раствора NaOH (4% раствор NaOH, разведенный в 20 раз) до тех пор, пока цвет содержимого этой пробирки совпадет со стандартом рН 7,4. Так, для 2 мл среды потребовалось 0,32 мл N/20 .ЧаОН. Для приготовления 1000 мл среды необходимо произвети расчет по уравнению:

 

   0,32-1000   

х = —— = 160 (мл)

       2

Т.е. к 1 л питательной среды нужно  прибавить 160 мл N/20 раствора или 8 мл нормального  раствора щелочи. Этот способ дает возможность   установить  рН   больших   количеств   питательной реды.

Для определения рН плотных питательных  сред их расплавляют и наливают в  пробирки компаратора горячую дистиллированную воду. Возможно определение рН с использованием pH-метров.

После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда тановится более кислой.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости  от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализещией или фильтрованием.

3. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Подготовленные к употреблению питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37°С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут., простерилизонанные текучим паром — 3 сут.

Техника посева микроорганизмов

Бактериологический метод—выделение чистых культур микробов и их последующая идентификация — имеет большое зна чении в диагностике инфекционных заболеваний, при изучении санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (вода, воздух, почва, продукты питания) и исследовании их по эпизоотическим и эпидемиологическим показателям на зараженность патогенными видами микробов, Однако первым этапом этой методики является посев или пересев бактериальной культуры на различные типы питательной среды.

Материалом для посева могут  быть пересеваемые культуры бактерий, различные выделения животных и  человека, ткани трупа, вода, почва, продукты питания.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тон куто прозрачную пленку—«зеркало». Пипетками пользуются н том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

 

  

 

 

 

Рис. 4. Схема пересева культуры микробов из пробирки в пробирку

Способ   взятия   плотного   материала   определяется   его   консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериальной петлей. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением пкробных культур, производят над пламенем горелки. Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно еред взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при ресеве микробной культуры с  пробирки горячую петлю  погружают в конденсационную жидкость, а при пересеве с чашек петри прикасаются к поверхности питательной среды, свободой от микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар при соприкосновении со средой. После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели используемые для посевов, так же как и бактериальные  петли, перед посевом прожигают, а после посевов опускают в  дезинфицирующий раствор.

Перед посевом вся посуда проверяется  на целостность, далее, на чашках Петри  со стороны дна, на пробирках в  верхней трети, надписывают название засеянного материала или ставят номер анализа и дату посева.

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду.  Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.

2. При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пpoбирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают пpaвой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания нее посторонних микроорганизмов из воздуха.

Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вво дят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность  пита тельной среды и скользящими  движениями наносят штрих снизу  вверх, от одной стенки пробирки к  другой (Рис.  4).

3. При посеве на поверхность плотной питательной среды чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой — IV и V пальцами, Крышку,   приоткрытую   настолько,   чтобы   в   образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами (Рис.   5). Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала.  Линию посева начинают с того места, в котором находится материалу.Бактериальную  петлю  кладут  плашмя  на  питательную среду чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей  среде   или   по секторам,   разграфив  предварительно  дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изоли-рованные колонии микроорганизмов.

 

Рис. 5. Посев на плотную питательную  среду в чашки Петри.

Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться иместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале  микробов они растут в  пленки, покрывающей  всю поверхность питательной  среды. Такой характер микробного роста  получил название сплошного, или  газонного. Посев газоном производят, когда нужно по-лучить большие  количества микробной культуры одного вида.

4. Из материала, подлежащего посеву в толшу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде пли в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнеиия) в выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15—20 мл мясо-пептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40—45°С (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к ще-ке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде за-крытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола,

5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

Получение чистых культур

Чистой культурой микробов называют популяцию микроор ганизмов одного вида, полученную из изолированной  микробной колонии. Под микробной  колонией подразумевается потомство  бактерий, возникающее в результате размножения одной мик робной клетки.

Выделение чистой культуры микробов является обязательным эталом всякого  бактериологического исследования, Чистая куль тура необходима для изучения морфологических, культур куль туральных, биохимических и антигенных свойств, по со вокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, со держащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды.

Очень широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие  развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.