Эритропоэтин: открытие и достижения

ЭРИТРОПОЭТИН: ОТКРЫТИЯ И ДОСТИЖЕНИЯ 
 

100 лет назад  был впервые обнаружен этот  гормон 

Эритропоэтин, гормон эритропоэза, в противоположность многим "классическим" гормонам, прошел длинный путь через

череду открытий и заблуждений  к потрясающим  научным и клиническим достижениям.

Несмотря на все былые неудачи, разочарования  и трудности,  этот "мифический" или "неуловимый" объект неустанных поисков ученых стал реальностью, обрел  молекулярно-генетические очертания  и, что особенно важно, нашел широкое  клиническое применение. 

Сквозь сомнения и неудачи 
 

Постоянный уровень  эритроцитов в организме поддерживается строгой координацией между образованием и разрушением клеток

красной крови (эритроидных клеток). В нормальных условиях эти противоположные процессы находятся в состоянии устойчивого динамического равновесия, которое поддерживается регуляторными механизмами. Долгое время считали,  что фактором,

регулирующим  эритропоэз, является величина кислородного напряжения в костном мозгу. Предполагалось, что костный мозг даже в норме испытывает некоторое кислородное голодание, которое оказывает прямое стимулирующее действие на эритропоэз. Эта "гипоксическая" теория находила подтверждение в опытах и наблюдениях, показавших резкое увеличение образования эритроцитов при понижении

парциального  давления в воздухе, и, следовательно, в крови.

Однако прямое стимулирующее влияние гипоксии на эритропоэз доказать не удалось. Напротив, выяснилось, что для усиления деятельности эритроидного костного мозга необходимо нормальное или даже

повышенное содержание кислорода. После тщательных и многолетних исследований удалось установить, что гипоксия стимулирует эритропоэз в костном мозгу не прямо, а путем образования гуморального медиатора - эритропоэтина. 

Столетие со дня рождения гипотезы о гуморальной  регуляции эритропоэза можно условно разделить на три периода:

1) гуморально-клеточный, 2) молекулярно-генетический и 3) клинический. 
 

В 1906 г. Carnot и Deflandre впервые обнаружили, что сыворотка крови кроликов, полученная через 20 часов после кровопускания, стимулирует эритропоэз у нормальных кроликов-реципиентов. После парентерального введения такой "анемической" сыворотки у животных развивался

эритроцитоз с  нормобластической гиперплазией и увеличением числа митозов в костном мозгу. Стимулирующее действие сыворотки авторы этого открытия объясняли появлением в ней эритропоэтически активного вещества,  названного ими "гемопоэтином". Эритропоэтическая активность была обнаружена также и в сыворотке крови животных, помещенных на несколько часов в барокамеру с низким парциальным давлением кислорода, а также после введения гемолитического яда - фенилгидразина.

В 30-х годах  появились сообщения нескольких авторов, которые отрицали или ставили  под сомнение присутствие "гемопоэтина" в сыворотке крови анемизированных или "гипоксических" животных. Эти работы на два

десятилетия значительно  ослабили интерес ученых к концепции  о гуморальной регуляции эритропоэза. Однако в начале 50-х годов появились новые и оригинальные данные, убедительно доказавшие существование "гемопоэтина".

В 1950 г. Reissman на парабиотических крысах доказал, что влияние гипоксии на костный мозг осуществляется не прямым путем, а посредством образования гуморального фактора, названного "эритропоэтином", объяснял неудачу некоторых прежних опытов слишком малым количеством вводимой сыворотки. И действительно, Erslev в 1953 г. после введения нормальным кроликам "анемической" плазмы по 50 мл ежедневно в течение 4 дней наблюдал на 5-6-й день от начала инъекций повышение числа ретикулоцитов в 3-4 раза, а после 13  инъекций - значительное увеличение числа эритроцитов, величины гематокрита и процента эритроидных клеток в костном мозгу. 
 

Дальнейшим толчком  к изучению эритропоэтина послужили клинические наблюдения над случаями вторичного эритроцитоза у пациентов с незаращенным боталловым протоком (Stohlman, 1954). У этих пациентов

насыщение и  давление О2 в крови подключичной артерии и в костном мозгу грудины было нормальным, тогда как эти величины в бедренной артерии и в костном мозгу подвздошной кости - значительно уменьшены. Однако и в нормально оксигенированном костном мозгу грудины и в гипоксическом костном мозгу подвздошной кости была обнаружена эритроидная гиперплазия. Эти наблюдения исключали прямое стимулирующее влияние гипоксии на костный мозг и доказывали ее действие посредством образования эритропоэтина. 
 

Итак,  эритропоэтин (ЭПО) образуется в условиях гипоксии. Но в каком органе или в какой ткани? Вопрос о месте образования ЭПО в организме был спорным и противоречивым, пока в 1957 г. в лаборатории    Jacobson не было обнаружено, что после двухсторонней нефрэктомии крысы и кролики утрачивают способность реагировать на кровопускание или на

введение солей  Co++ (вызывают тканевую гипоксию) повышением титра ЭПО в плазме.

Проведенные в  дальнейшем многочисленные и разнообразные  экспериментальные и клинические  наблюдения установили непреложный  факт, что главным местом образования  ЭПО являются почки. 
 

В 60-е годы появились  первые работы по изучению механизмов на клеточном и молекулярном уровнях, были разработаны 

высокочувствительные  методы определения ЭПО в сыворотке  крови (с-ЭПО) и методы клонирования коммитированных эритроидных предшественников - бурстобразующих и колониеобразующих эритроидных единиц (БОЕ-Э и КОЕ-Э). В 1976 г. Международной комиссией по биохимической номенклатуре (JUPAC-JUB) ЭПО был признан гормоном и

включен в Международную классификацию пептидных гормонов. 
 

Гипоксия - главный  стимул для образования ЭПО. Под  ее влиянием кислородный сенсор в  почках индуцирует синтез гормона,

который поступает в циркуляцию крови и действует на клетки-мишени в костном мозгу (БОЕ-Э и КОЕ-Э) В результате взаимодействия между ЭПО, ЭПО-чувствительными клетками (ЭЧК) и их микроокружением возникает ответная реакция, а именно - дифференциация, пролиферация и созревание эритроидных предшественников. Кроме того, ЭПО предотвращает апоптоз эритроидных предшественников, то есть способствует их выживаемости, уменьшая таким образом неэффективный эритропоэз. 

Выделение гена 
 

Молекулярно-генетический период истории ЭПО начинается с  успешного выделения и очистки  нескольких миллиграммов гормона из

огромного количества мочи (1500 л) пациентов с апластической анемией в 1977 г. По биохимической природе ЭПО относится к группе кислых гликопротеинов. Эти соединения представляют собой белки, содержащие в качестве простетических групп гетеросахариды с небольшим числом моносахаридных остатков, присоединенных ковалентно к полипептидной цепи. Такие конзюгированные с углеводами белки обладают характерной повышенной растворимостью и термостабильностью. Первичная

структура ЭПО  стала известной в 1980 г. в связи  с успехами в области 

молекулярной  биологии. Клонирование и экспрессия гена ЭПО, расположенного на хромосоме 7 в области 11-22, позволили охарактеризовать молекулярные процессы синтеза ЭПО. На модели "эндокринной" почки по Г.Селье было показано, что

биогенез ЭПО  происходит по обычной схеме образования  белка и включает в себя депрессию  синтеза РНК, специфичных для  гормона (Е.Морщакова, 1978).  
 

После успешного  выделения и клонирования ЭПО-гена в разных лабораториях были разработаны  модели O2-ceнcopныx механизмов

экспрессии ЭПО-гена (Fandrey, 1990; Fisher, 1993). На основании предложенных моделей можно сделать заключение, что существуют, вероятно, множественные пути восприятия кислорода в ЭПО-продуцирующих клетках. Клеточные сенсоры О2 дают

возможность клеткам "зондировать" наличие кислорода  в их окружении и 

регулировать  функции клетки-продуцента ЭПО. Эти  функции направлены на ликвидацию

любого несоответствия между потребностями в кислороде  и снабжением им. Наиболее привлекательной  гипотезой,  на наш взгляд, является идея о вовлечении гемового белка в молекулярные механизмы кислородного сенсора в ЭПО-продуцирующих клетках.

Механизмы могут  быть связаны с окси-деоксиконформационными изменениями гемового

белка или с  продукцией реактивных   видов  кислорода из молекулярного.  Областью

почки, где располагаются  О2-сенсорные и ЭПО-вырабатывающие клетки  является

корковый слой.  
 

Функции ЭПО  передаются посредством специфического ЭПО-рецептора (ЭПО-Р). Недавнее клонирование ЭПО-Р-гена значительно облегчило молекулярный анализ структуры и функции этого рецептора.

Ген для ЭПО-рецептора  обнаружен на хромосоме 19 у человека; он кодирует белок, состоящий из 507 аминокислот  и содержащий одну связанную с  мембраной область. ЭПО связывается  с двумя молекулами ЭПО-Р. Это  приводит к гомодимеризации

рецептора с  последующей активацией нескольких путей сигнальной трансдукции 

(передачи сигнала). ЭПО генерирует сигналы как для дифференциации, так и для

пролиферации  эритроидных коммитированных предшественников. Эритроидная

дифференциация  в молекулярном аспекте означает экспрессию генов, определяющих

синтез специфических  белков эритрона, главным образом гемоглобина.  
 

Нормальная функция  системы эритрона обусловлена тремя основными компонентами: нормальной почечной продукцией ЭПО,

функционирующим эритроидным костным мозгом и адекватным снабжением субстратами (железом). Дефект какого-либо из этих компонентов может привести к развитию анемии. Показателем почечной продукции ЭПО является содержание ЭПО в сыворотке крови. Продукция ЭПО регулируется в узких пределах, и уровень с-ЭПО не повышается за пределы нормы (6-25 мМЕ/мл) до тех пор, пока концентрация Hb не падает ниже 100-120 г/л. При наличии нормального ЭПО-образующего аппарата в почках уровни гормона в сыворотке повышаются экспоненциально уменьшению концентрации Hb или гематокрита. В этих случаях почечная продукция ЭПО в ответ

на вызванную  анемией гипоксию является адекватной. Примерами адекватной продукции ЭПО могут быть: железодефицитная анемия, гемолиз,  кровопотеря, апластическая анемия, неэффективный эритропоэз. При неадекватной продукции ЭПО в

ответ на анемию наблюдается ослабление или даже утрата регулируемой зависимости 

с-ЭПО от уровня Hb относительно такой зависимости у "эталонных" пациентов с

адекватной реакцией ЭПО на данную степень анемии. Как  правило,  в качестве

эталона используют корреляцию уровней с-ЭПО и Hb у пациентов с железодефицитной

анемией. Неадекватная продукция ЭПО наиболее часто  наблюдается у пациентов с

хронической почечной недостаточностью, хроническими болезнями,  злокачественными

новообразованиями. 

"Клиническая  эра" 
 

Революционным событием в истории ЭПО стало 

получение рекомбинантного человеческого ЭПО (рч-ЭПО) методами генной инженерии.

Разработка методов  получения рч-ЭПО была кооперативной, многонациональной и включала усилия ученых и специалистов   фармацевтических компаний. Испытания полученного препарата (эпоэтин-альфа) на животных, донорах-добровольцах и в

клинике были проведены  в Европе, США, Канаде и в Японии и дали блестящие результаты. Препарат оказался высокоэффективным и почти  без побочных эффектов.

Первые публикации результатов клинических испытаний рч-ЭПО для лечения анемии пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) появились уже в 1986-87 гг. Результаты превзошли все ожидания, и началась "клиническая эра" ЭПО, который стал использоваться для лечения целого ряда анемий с низкой и неадекватной продукцией эндогенного гормона.