Контрольная работа по "Токсикологии"

1.3. Перечислить особенности и этапы химико - токсикологического анализа.

Химико- токсикологический  анализ представляет собой совокупность научно обоснованных методов, применяемых  на практике для выделения,обнаружения  и количественного определения  токсических веществ.

Химико-токсикологический анализ имеет ряд особенностей.

Для обнаружения и количественного  определения токсических веществ в химико-токсикологическом анализе используется ряд реакций и методов, применяемых в аналитической и фармацевтической химии. Однако многие эти реакции и методы, ввиду малой чувствительности или неспецифичности, непригодны для целей химико-токсикологического анализа.

Химико-токсикологический анализ характеризуется разнообразием  объектов исследования, содержащих незначительные количества токсических веществ.

Объектами исследования могут быть  биологические жидкости (кровь, моча), рвотные массы, внутренние органы трупов людей, волосы, ногти, остатки пищевых  продуктов и напитков, лекарственных  средств, пестициды, препараты бытовой  химии, посуда, предметы домашнего обихода, одежда, вода, земля и т.д.

Химико-токсикологическое  исследование биологического материала  на наличие токсических веществ состоит из нескольких этапов: изолирование исследуемых соединений из объектов биологического происхождения, очистка полученных вытяжек от примесей, выделение исследуемых веществ из предварительно очищенных вытяжек, идентификация и количественное определение выделенных веществ. 

Необходимость изолирования (извлечения) малых количеств искомых  химических веществ из сравнительно большого количества объекта исследования.

От методов изолирования нередко зависит дальнейший ход  химического анализа и даже его  результаты.

Важной особенностью является необходимость правильной оценки результатов анализа - экспертное заключение. Эксперт имеет возможность говорить лишь об обнаружении или необнаружении искомого вещества, так как, исходя из природы химического вещества, учета чувствительности применяемых методов, отрицательный результат исследования не всегда свидетельствует об отсутствии ядовитого вещества (следы его могут оставаться в объекте, но не обнаруживаться). И наоборот, некоторые из веществ, на которые токсикология называет как на ядовитые, являются естественными составными частями организма (катионы Си, As, Hg, Zn, Pb и др.). Они могут быть обнаружены и определены в процессе анализа, однако не являться причиной отравления.

Присутствие ядовитого вещества, не всегда является доказательством  его введения в организм с целью  отравления, т.к. многие из них, например, барбитураты, алкалоиды и другие азотсодержащие вещества основного  характера, являются лекарственными. В этих случаях обязательна количественная оценка.

Для выполнения отдельных этапов химико-токсикологического анализа применяются соответствующие  химические, физические и физико-химические методы.

Выбор методов выделения токсических веществ зависит от характера объекта исследования. При использовании неподходящего метода выделения токсического вещества из исследуемого объекта оно может быть частично или полностью потеряно в ходе химико-токсикологического анализа. Причем в ряде случаев для выделения одного и того же вещества из различных объектов необходимо применять разные методы.

Одной из особенностей химико-токсикологического анализа является и то, что наряду с исследованием веществ, вызвавших отравление, необходимо выделять из биологического материала и определять их метаболиты.

Учитывая, что в трупном материале  содержится незначительное количество вещества, вызвавшего отравление, для обнаружения этоговещества необходимо применять чувствительные реакции.

Однако при использовании высокочувствительных реакций в вытяжках из биологического материала можно обнаружить не только ядовитое вещество, вызвавшее отравление, но и некоторые вещества(соединения металлов), являющиеся составной частью клеток и тканей организма ,а также лекарственные вещества, принятые перед смертью в терапевтических дозах с лечебной целью. Поэтому эксперт-химик должен уметь правильно оценить результаты применяемых им реакций обнаружения исследуемых веществ.

 

 

 

 

 

19. Методы очистки производных барбитуровой кислоты, выделенных из биоматериала. Приведите примеры.

В современной медицине применяется  большое число барбитуратов (производных  барбитуровой кислоты).

Барбитураты представляют собой  одну из групп веществ, имеющих большое  токсикологическое значение.                                                                                 Сама барбитуровая кислота (малонилмочевина) не применяется в медицине, зато широко используются ее производные.

Барбитуровая кислота  является циклическим уреидом и  может рассматриваться как производное  пиримидина (2,4,6-триоксипиримидин). Атомы  водорода метиленовой группы в 5 положении пиримидинового цикла, а также водород, стоящий у атомов азота в 1 и 3 положениях, подвижны и способны замещаться различными органическими радикалами, атом кислорода в положении 2 также способен замещаться на атом S.

 На этих свойствах  и основан синтез производных  барбитуровой кислоты. 
Общую формулу барбитуратов можно изобразить следующим образом: 
 
где R1, R2, R3 – радикалы, содержащие от 1 до 7 атомов углерода.

Кислотные (молекулярные) формы  барбитуратов растворимы в эфире, хлороформе, спирте и некоторых других органических растворителях, натриевые производные  – в воде.

По физическим свойствам  все интересующие в настоящее  время токсикологию барбитураты являются твердыми, в большинстве случаев кристаллическими порошками без запаха, горького вкуса. 
Барбитураты имеют высокие температуры плавления, возгоняются без разложения, что используется для их очистки от посторонних примесей при выделении из биоматериала.

 

Химико-токсикологическое  исследование барбитуратов 
Этапы исследования: 
1. Изолирование из объекта. 
2. Очистка полученного извлечения.

3.Идентификация.  Для идентификации барбитуратов используют химические, физические и физико-химические методы анализа. 
К химическим методам можно отнести реакции окрашивания барбитуратов.

4. Количественное определение.  Для количественного определения  барбитуратов в настоящее время  используется спектрофотометрический  метод. 

Как правило, барбитураты, выделенные из биологического материала, содержат примеси посторонних веществ, которые  извлекаются совместно с барбитуратами  и являются нормальными компонентами организма (жиры, белки, пигменты, дубильные, смолообразные вещества и др.). Соэкстрактивные (балластные) вещества мешают дальнейшей идентификации и определению  барбитурата. 
Выбор метода очистки зависит, в основном, от количества изолированного вещества и, до некоторой степени, от его химического строения. Экстракционная очистка основана на способности барбитуратов к имидо-имидольной таутомерии и на различной растворимости имидной и имидольной форм в воде и органических растворителях.                       Используя реэкстракцию барбитурата раствором гидроксида натрия из органической фазы, тем самым освобождаются от сопутствующих веществ, нерастворимых в воде (натриевые соли хорошо растворимы воде и извлекаются ею).                                                                                              Последующее выделение барбитурата из водной фазы проводят после подкисления водного раствора (рН=2) экстрагированием органическим растворителем. При этом барбитурат в молекулярной форме извлекается органическим растворителем, а в водной фазе остаются балластные вещества, не растворимые в органическом растворителе. 
Микросублимация основана на способности барбитуратов возгоняться без разложения при нагревании. 
При малых количествах выделенных веществ чаще используют хроматографические методы очистки (ионообменную и гель-хроматографию на колонке, ТСХ, ВЭТСХ, ВЭЖХ). 

С точки зрения простоты, доступности и разрешающей способности  наибольшего внимания заслуживают  ТСХ, ВЭТСХ.

Они позволяют не только очистить выделенные вещества от примесей, но и разделить целый ряд барбитуратов при их совместном присутствии, а  также отделить барбитураты от их метаболитов и провести предварительную  идентификацию.

Возгонка  применяется только при больших  количествах барбитурата. Возгонка проводится в нагревательной камере прибора Кофлера, либо в упрощенном виде, с одного предметного стекла на другое, верхнее из которых охлаждается, а нижнее с исследуемым остатком нагревается.

Для возгонки часть остатка помещают на предметное стекло. На него же кладут стеклянное кольцо диаметром около 1,5-2 см и высотой не более 1 см с хорошо притертыми краями (газовая камера). Газовую камеру закрывают вторым предметным стеклом, охлаждаемым сверху ватным или бумажным влажным тампоном. При нагревании нижнего стекла происходит возгонка барбитурата. Возгон осаждается на нижней поверхности верхнего стекла.    Его исследуют под микроскопом и химическими реакциями.

Широкое распространение среди методов  очистки барбитуратов к настоящему времени приобрели хроматографические методы и, в частности, хроматография в тонком слое.                                                                                               В нашей стране вопросам применения хроматографии в тонком слое для очистки, разделения барбитуратов, отделения их от метаболитов и предварительной идентификации посвящены работы Н. В. Кокшаровой, Е. В. Ме-телевой, Г. Ф. Лозовой, А. В. Беловой и И. В. Волковой и др.

Чаще  всего для очистки барбитуратов используют сочетание экстракции с  хроматографией в тонком слое.                                                                           Например, применяют реэкстракцию барбитуратов из «кислой» хлороформной вытяжки в 0,1 н. раствор едкого натра, а затем после подкисления до рН 2,0 соляной кислотой вновь в хлороформный слой (2 порции по 20 мл). Хлороформные вытяжки объединяют, доводят (в мерной колбе) до 50 мл и подвергают качественному и количественному анализу после хроматографирования в тонком закрепленном слое силикагеля КСК на пластинках размером 9X12 см.

Система растворителей: хлороформ -н. бутанол - 25% аммиак 70:40:5.         Длина пробега фронта растворителя-10 см; время хроматографирования 45-60 минут.

 

Для предварительного обнаружения барбитуратов 2 мл хлороформной вытяжки упаривают до 0,25 мл и количественно наносят в виде точки на стартовую линию хроматографической пластинки. На расстоянии 2 см от этой точки на ту же стартовую линию наносят по 0,02 мл (20 мкг) метаноловых растворов барбитала, фенобарбитала и этаминала натрия - свидетели (метчики).                                                                                   Обнаружение на пластинке производят опрыскиванием 0,01% раствором дифенилкарбазона в хлороформе, а затем 5% раствором HgSО₄ красно- или сине-фиолетовые пятна в зоне расположения барбитуратов.

Реакция взаимодействия барбитуратов с солями ртути и ди-фенилкарбазоном имеет  отрицательное судебно-химическое значение, т. е. при отсутствии на хроматограмме красно- или синефиолетовых пятен дальнейшее исследование на барбитураты не производят.                                                                                    При получении пятен и соответствующем значении Rf проводится повторное хроматографирование больших объемов хлороформных экстрактов из кислых растворов для дальнейшего качественного обнаружения барбитурата и его количественного определения.

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой. 

Подщелоченную воду для изолирования барбитуратов из биологического материала впервые применил П. Валов.                                   Для осаждения примесей, переходящих из биологического материала в вытяжки, он использовал вольфрамат натрия. В настоящее время известно несколько модификаций метода Валова. Одна из модификаций метода Валова, предложенная М. Д. Швайковой.

В стакан или в коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 180 мл воды и 20 мл 10%раствора гидроксида натрия. Содержимое стакана (или колбы) оставляют на 30 мин при частом перемешивании, а затем центрифугируют в течение 30 мин (3000 об/мин).

От осадка отделяют надосадочную жидкость (центрифугат), к которой прибавляют 120 мл 10 %-го раствора вольфрамата натрия и1н. раствор серной кислоты (до pH = 2).                                Жидкость нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, а затем подвергают центрифугированию (30 мин).                                                     Центрифугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон, смоченный водой. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку. 

Тампон промывают водой (10 мл). Промывную воду тоже выливают в делительную воронку. К процеженной жидкости прибавляют равный объем диэтилового эфира и взбалтывают в течение 15 мин.

Эфирный слой отделяют и взбалтывают с 50 мл 10 % раствора гидроксида натрия. Щелочной водный слой отделяют, подкисляют 25 %  раствором серной кислоты до рН = 2 и взбалтывают с равным объемом диэтилового эфира.

Полученную при этом эфирную  вытяжку используют для обнаружения  и количественного определения  барбитуратов.

Для обнаружения барбитуратов применяются  цветные реакции, реакции осаждения, микрокристаллоскопические реакции, методыхроматографии, УФ- и ИК-спектроскопии и др.

Предварительная проба. Для обнаружения барбитуратов в моче применяют предварительную пробу, основанную на реакции этих веществ с ацетатом кобальта и гидроксидом лития.