Лабораторная диагностика гепатита C

 

Несколько замечаний по технической стороне оценки  ПЦР . Во-первых, применяемые методики качественные. Для по-настоящему полуколичественной  ПЦР  требуются специальные амплификаторы с возможностью кинетических измерений продуктов реакции. Все остальные варианты с титрованием и фотометрией считаются недостоверными. И даже при наличии специального оборудования реакции считаются полуколичественными, так как на этапе выделения РНК возможны потери генетического материала в ходе неоднократных осаждение и очистки. На выход материала влияет и то обстоятельство, что вирус гепатита  С, извлеченный из крови, очень неустойчив во внешней среде и легко разрушается РНКазами, даже находящимися в выдыхаемом воздухе. В течение последнего года у нас имелся двухнедельный период, когда мы не могли выделить РНК вируса  гепатита  С, при том что РНК вируса клещевого энцефалита в этих же условиях сохранялась полностью. Какую-то роль при этом играло и систематическое применение препарата DNA-erase для обработки помещений и оборудования. Этап выделения РНК, таким образом, является достаточно сложным для стандартизации. Вероятно именно по этой причине обычная ПЦР и “нестед”- ПЦР , которые теоретически должны отличаться по чувствительности в 1000 раз, согласно паспортным данным, отличаются всего в 5 раз. Вероятно, 200 геномов на пробу - это тот предел, ниже которого до этапа амплификации может не дойти ни одного. Важнейшим фактором при этом является наличие генетического материала в пробе, то есть, правильный забор материала важен как и для любой другой методики. Касательно  гепатита  С, на 10 международном симпозиуме по вирусным гепатитам и заболеваниям печени, проходившем 9 - 13 апреля этого года в г. Атланте, французские ученые Peignoux-Martinot и др. представили результаты наблюдения за 135 пациентами в течение 7 лет. Согласно их данным, у 31 % больных РНК в крови не детектировалась, и за семь лет наблюдения эта ситуация не изменилась. Из этих данных следует, что если положительный результат подтверждает наличие гепатита  С почти на 100 %, то отрицательный соответствует истине с вероятностью 1 : 2, что явно недостаточно для постановки диагноза. Если эти данные подтвердятся в дальнейшем, то единственной прерогативой  ПЦР будет контроль за проводимой терапией, но не ранняя  диагностика . На том же симпозиуме американскими учеными Prince и др. изложены механизмы транспортировки HCV в крови, что дает надежду на скорое появление массовых дешевых тест-систем для определения cor-белка, появление которого в начале заболевания предшествует появлению РНК, а тандем Cor - анти-cor теоретически должен определяться в любое время, независимо от стадии. И, наконец, последняя информация из материалов симпозиума. Американские ученые Yeo A.T. и др. пытались установить зависимость между тяжестью поражения печени и уровнем РНК на основании количественной ПРЦ. Они сделали три вывода:

 

1. У большинства пациентов (98,4%) имеется нестабильный уровень  РНК, меняющийся от измерения  к измерению более чем на 1 логарифм.

 

2. Не существует связи между  гистологическим повреждением печени  и уровнем РНК, генотипом, полом,  расой и возрастом.

 

3. Наблюдается зависимость между  повышенной активностью сывороточной ALT и гистологическим повреждением  печени.

 

Подводя итог вступительной части, можно подчеркнуть, что оценка метода  ПЦР  является очень неоднозначной, и прежде чем пытаться провести подобную оценку, нам необходимо определиться с тем эталоном, с которым можно  сравнить полученные нами результаты. При отсутствии гистологического контроля для нас единственной возможностью верификации  гепатита  С является только исследование маркеров (спектра антител), при совпадении результатов которой достоверность, как я уже упоминал, очень высока.

 

К сожалению, из выше упомянутых тысяч  обследованных, одновременно исследовать  ПЦР  и маркеры смогли позволить  себе лишь 31 человек, из которых двое исследовали по одному маркеру, а, значит, не удовлетворяют нашим критериям. Таким образом, в качестве референтной группы взята группа из 29 человек, из которых 20 являются истинно положительными и 9 истинно отрицательными. Результаты  ПЦР в данных группах обнаруживают 2 ложноположительных и 2 ложноотрицательных результата. Отсюда диагностическая значимость положительных и отрицательных результатов составляет соответственно 92 и 81 %. Учитывая небольшую величину выборки, говорить о достоверности выводов не приходится, хотя явно прослеживается тенденция большей информативности положительных результатов. Не исключено, что на большой выборке эта цифра приблизится к паспортному значению в 98%. Что касается значимости отрицательных результатов, то можно добавить, что в нашей лаборатории проводилось обследование группы лиц с ранее установленным диагнозом гепатита  С и процент отрицательных результатов был довольно значительным (до 20 – 30%), причем части из них для подтверждения диагноза была сделана биопсия.

 

На сегодняшний день метод  ПЦР  в диагностике  гепатита  С не является ни панацеей, ни «золотым стандартом». Ему присущи некоторые достоинства и множественные недостатки, проистекающие из этих достоинств. Метод не может быть рекомендован ни для скрининга (особенно в службе крови), ни для ранней диагностики HCV. Он не может заменить ни исследование уровня ALT, ни исследование гистологической картины. В целом это еще один из методов диагностики, позволяющий улучшить диагностику в сложных и неясных случаях.

 

Что такое ПЦР?

 

Полимеразная цепная реакция (Polymerase chain reaction), более известная как "ПЦР" (PCR) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным.

 

Часто её описывают как метод, с  помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить  стог из этих игл.

«Иглой» является крошечный фрагмент генетического материала клеток, представленный в виде ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота), которые в свою очередь состоят из нескольких миллиардов нуклеотидов. Примечательно, если нить ДНК вытянуть, то ее длина составит около 2 метров. Но в составе клеточного ядра она настолько компактно свернута в спираль, что ее диаметр составляет сего лишь тысячную миллиметра.

ПЦР имитирует естественный процесс  репликации (размножения) ДНК, в результате чего, в течение нескольких часов  из одного фрагмента молекулы ДНК  можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить  генетический материал, присутствующий в крошечных количествах.

Достоинства метода ПЦР:

 

    Среди методов диагностики  инфекционных возбудителей, ПЦР  обладает наиболее высокими показателями  чувствительности (за счет экспоненциального  накопления фрагментов ДНК) и  специфичности (за счет выявления  уникальных для микро-(макро)-организмов участков генетического материала).

    Аналитическая чувствительность  АмплиСенс ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий - 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала.

    Специфичность ПЦР при  использовании технологии АмплиСенс для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.

    Возможность использования  разнообразного клинического материала.

    Возможность одновременного  выявления нескольких микроорганизмов  в одной биологической пробе,  в отличие от бактериологических  методов, где для разных возбудителей  используются разные способы  культивирования.

    Простые требования к  условиям хранения и транспортировки  материала от пациента в лабораторию.  Повышена стабильность при транспортировке  до лаборатории, поскольку нет  необходимости сохранять возбудителя  в живом виде, в отличие от  бактериологических и вирусологических  методов.

    Скорость проведения  анализа: время получения результатов,  для некоторых инфекций меньше, чем 24 часа.

    Для некоторых микроорганизмов  (например, Mycoplasma genitalium) ПЦР – единственный метод диагностики.

 

Но, несмотря на все достоинства  ПЦР, преимущественное его использование  для выявления инфекционного  возбудителя применимо не ко всем микроорганизмам.

 

Так, например, для таких возбудителей как стафилококк или стрептококк  лучше использовать микробиологический метод, а для диагностики бруцеллеза, бореллиоза, токсоплазмоза, краснухи, кори – целесообразнее использовать иммунологические методы (например, ИФА).

ПЦР в диагностике инфекционных болезней

 

Метод ПЦР

 

    Определить этиологию  инфекции (т.е. какой именно микроорганизм  или их сочетание вызвали воспалительный  процесс). Для некоторых возбудителей, например, Mycoplasma genitallium (010102), ПЦР – это единственный метод диагностики на сегодняшний день. В зависимости от ответа на данный вопрос вырабатывается тактика лечения.

    Определить количество  возбудителя. Особенно это актуально  для условно-патогенных микроорганизмов  (Gardnerella vaginalis (010201) и др.), которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).

    Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.

 

Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя  даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном  течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами (гонорея, трихомоноз (020201), хламидийная инфекция (010001)). Например, при хронической гонорее у женщин даже с помощью бактериологического метода часто не удается выявить гонококк, несмотря на имеющиеся симптомы хронического воспалительного процесса в шейке матки или уретре.

ПЦР в диагностике гепатитов

 

    Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:

        Установить  факт инфицированности гепатитом  С. Во-первых, это важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК (030202), и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.

        Установить  наличие показаний к противовирусному  лечению, а также выбрать оптимальную  схему лечения. Решить эти вопросы  помогают количественное определение  уровня РНК ВГС (030204) (при низкой  вирусной нагрузке эффективность  лечения выше) и определение генотипа  ВГС (030205) (генотип 1 хуже отвечает  на противовирусную терапию по  сравнению с генотипами 2 и 3).

        Своевременно  оценить эффективность проводимого  лечения. Так, наиболее эффективными  препаратами для лечения хронического  гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.

        Оценить устойчивость  ответа на лечение. Для этого  проводят обнаружение РНК ВГС  после окончания лечения, через  24 недели и через 72 недели после  окончания лечения.

В заключение необходимо отметить, что до сих пор идут споры о  месте ПЦР в современной системе  лабораторной диагностики инфекционных болезней. Однако, как мы попытались показать в настоящем обзоре, уже  на данном этапе развития ПЦР является самым чувствительным и специфичным  методом прямого обнаружения  возбудителей, позволяющим не только устанавливать этиологию заболевания, но и осуществлять контроль за течением инфекционного процесса и оценивать эффективность проводимой терапии. Учитывая все вышесказанное, становится очевидным, что полимеразная цепная реакция является необходимым и обязательным методом обследования пациентов, и должна находиться в арсенале каждого врача, занимающегося инфекционной патологией.

 

Количественное определение РНК  вируса гепатита С методом ПЦР (вирусная нагрузка).

 

Аналитические показатели. Выявление  РНК вируса гепатита С (hepatitis С virus) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение вирусной нагрузки в сыворотке крови. Определяемый фрагмент - консервативный участок генома вируса гепатита С. Специфичность определения - 98%. Чувствительность определения - от 850 000 МЕ/мл до 600 МЕ/мл вирусных частиц в сыворотке крови.