Методы определения противоопухолевого действия антибиотиков

МИНОБРНАУКИ РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Южный федеральный университет»

Факультет биологических наук

Кафедра биохимии и микробиологии

РЕФЕРАТ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ.

                                                                                                   Выполнила:

                                                                                                            студентка 4 курса

Гавришева Анастасия.

Ростов-на-Дону - 2012

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТИВОРАКОВОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ

Одной из важнейших проблем, стоящих перед современной биологической и медицинской науками, является проблема поисков активных в терапевтических условиях препаратов, препятствующих или тормозящих развитие злокачественных новообразований.

Описано несколько антибиотических веществ, угнетающих развитие раковых клеток. К ним относятся: азасерин, саркозин, актиномицин С, аурантин, плурамицин, карцинофиллин, круцин и др. Однако все эти антибиотики наряду с угнетением различных форм рака оказывают сильное токсическое действие на организм больного. Поскольку еще до настоящего времени не выявлены причины, вызывающие развитие той или иной формы злокачественного новообразования, но имеют определенные трудности в работах, связанных с поисками новых противораковых антибиотиков. Тем не менее существуют специфические методы определения противоопухолевого действия веществ.

Не всегда антираковое действие препарата совпадает с антибактериальным или антигрибным действием, поэтому для определения противораковой активности культуральных жидкостей или очищенных препаратов в качестве тест-объектов используют непосредственно раковые клетки. С этой целью применяют методы, основанные на использовании экспериментальных животных, культуры тканей или свободноплавающих в отдельных полостях организма опухолевых клеток (асцитные клетки), но окончательно антиопухолевое действие испытуемого вещества оценивается в опытах на животных.

Методы с использованием экспериментальных животных.

В качестве тест-объекта применяют клетки асцитного рака Эрлиха у мышей (клетки находятся в виде взвеси в асцитической жидкости животных). Взвесь асцитных раковых клеток смешивают с равным объемом изучаемого антибиотического препарата и смесь помещают в рефрижератор при 4 °С на 4 ч, после чего ее прививают мышам (подкожно). Для контрольных животных вместо исследуемого препарата используют физиологический раствор. Через 10 дней мышей убивают и определяют наличие опухолей и их размеры. Если изучаемый препарат убивает асцитные раковые клетки, то они, естественно, не образуют опухолей. Тест-объектом могут служить клетки не только асцитного рака Эрлиха, но и других опухолей, полученных экспериментальным путем у мышей и крыс. Использование клеток различных опухолей связано с необходимостью более широкого изучения противоопухолевого действия исследуемых препаратов для более точного определения значения изучаемой культуральной жидкости или антибиотика в отношении их действия на раковые клетки. Прежде чем использовать опухоль в качестве тест-материала, необходимо из опухолевых тканей получить тонкую взвесь. С этой целью применяют следующий метод. В стерильных условиях вылущивают опухоль, тщательно очищают от некротических участков и несколько раз промывают стерильным физиологическим раствором. После этого отобранные в чашки Петри кусочки опухоли измельчают ножницами до получения гомогенной кашицы и разводят примерно в 2 раза стерильным физиологическим раствором. После тщательного размешивания взвесь фильтруют через два слоя стерильной марли. Затем определяют количество опухолевых частиц, содержащихся в 1 мл взвеси (подсчет проводят в камере Горяева). Если при подсчете оказывается, что количество частиц в 1 мл незначительно, то полученную взвесь концентрируют методом центрифугирования. Надосадочную жидкость отсасывают, а опухолевые клетки, осевшие на дно пробирки, разводят нужным объемом стерильного физиологического раствора. В дальнейшем постановка опыта со взвесью опухолевых клеток, приготовленной из опухоли животных, такая же, как и с клетками асцитного рака Эрлиха. Различие лишь в некотором удлинении срока наблюдения (до 12 дней). В опыте с клетками асцитного рака Эрлиха наблюдение ведут в течение 10 дней.

Чашечный метод.

Тест-объектом служат клетки асцитного рака, которые смешивают с теплой агаровой средой (пептон, глюкоза, плазма крови) и разливают в чашки Петри. На застывшую агаровую пластинку, содержащую клетки асцитного рака, накладывают агаровые блочки с выросшим микроорганизмом или диски фильтровальной бумаги, предварительно смоченные культуральной жидкостью или раствором очищенного препарата. Чашки помещают в холодильник на несколько часов для диффузии изучаемых веществ в толщу агара, содержащего асцитные раковые клетки 2*107 клеток в 1 мл). После этого чашки ставят в термостат при 37 °С на несколько часов и затем, вынув из термостата, освобождают от агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги. Поверхность агаровых пластинок заливают 0,05%-м раствором метиленового синего. Чашки покрывают стеклянными пластинками и снова помещают в термостат на несколько часов. При отсутствии действия антибиотика на клетки асцитного рака вся поверхность агаровой пластинки будет бесцветной. Если же изучаемые препараты убивают клетки асцитного рака, то на месте агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги появятся голубые зоны. Свойство обесцвечивать метиленовый синий, т.е. превращать его в лейкосоединение, связано с выделением живыми асцитными клетками ферментов дегидраз. Убитые клетки не выделяют дегидразы, и метиловый синий не обесцвечивается.

Следует отметить, что дегидразная активность раковых клеток может обнаруживаться с помощью не только метиленового синего, но и ряда других веществ, например 2,6-дихлорфенолиндофенола, солей тетразола. Способностью восстанавливать метиленовый синий обладают взвеси клеток разных опухолей животных и человека. Однако при использовании взвеси клеток опухолей их количество в 1 мл взвеси, необходимое для восстановления метиленового синего, различно (табл. 34).

Таблица 34

Количество клеток различных солидных опухолей животных и человека,

необходимое для восстановления метиленового синего

(по Талызиной, I960)

* Для асцитных раковых клеток — 2 • 107 в 1 мл.

Данные табл. 34 показывают, что, пользуясь чашечным методом, вполне возможно вести отбор противораковых веществ на раковых клетках человека, так как взвеси последних, как и клетки асцитного рака, восстанавливают метиленовый синий. Препараты, подавляющие или тормозящие рост опухоли, обычно подавляют и дегидразную активность соответствующей опухоли.

Пробирочный метод.

Модификацией чашечного метода служит метод испытания противораковой активности антибиотиков в пробирках. Метод состоит в следующем. В стандартные пробирки вносят 0,5 мл испытуемой культуральной жидкости и 0,5 мл взвеси клеток асцитного рака Эрлиха (конечная концентрация клеток 500 тыс/мл), затем добавляют 2 мл расплавленной агаровой среды, содержащей метиленовый синий. В контрольные пробирки вместо испытуемой культуральной жидкости добавляют 0,5 мл среды, на которой выращивают изучаемый организм. После перемешивания пробирки помещают на 3-4 ч в термостат при 36-37 °С. Если содержимое пробирок окрашивается метиленовым синим, то это указывает на то, что испытуемый препарат подавляет дегидразную активность клеток асцитного рака. Преимущество пробирочного метода по сравнению с чашечным состоит в том, что при этом происходит непосредственный контакт антибиотика с асцитными клетками Эрлиха независимо от степени диффузии изучаемого препарата в агар.

Использование микроорганизмов при изыскании противораковых антибиотиков.

Установлено, что обмен веществ в опухолевых клетках отличается от обмена нормальных клеток. Это различие, в частности, состоит в интенсивности дыхания. Так, интенсивность дыхания в опухолевых клетках по сравнению с нормальными в ряде случаев значительно снижена. В связи с этим Г. Ф. Гаузе высказал предположение о возможности использования мутантов микроорганизмов с пониженным коэффициентом дыхания в качестве тест-объектов для поисков противораковых антибиотиков.

В результате ультрафиолетового облучения, а также действия уретана удается получить мутанты стафилококков, бактерий кишечной группы и других организмов, имеющие пониженный коэффициент окисления. Поглощение кислорода у таких организмов может составлять 20-80% по сравнению с дыханием исходных родительских культур.

Последующими работами Г. Ф. Гаузе и сотрудников показано, что мутантные формы стафилококков имеют и другие особенности, сближающие их с злокачественными клетками, в том числе ослабленную активность каталазы, изменение состава клеточной оболочки.

Используя полученные биохимические мутанты в качестве тест-организмов при излучении 2500 культур различных актиномицетов, Т. П. Преображенский и Е. С. Кудрина выделили 53 культуры, которые обладали избирательным подавляющим действием на эти мутанты, но не угнетали рост других нормальных бактериальных организмов.

В. А. Талызина применяя мутантные штаммы Staph aureus 209 и Bact paracoli 52-1 для изучения различных культуральных жидкостей, пришла к аналогичным результатам, полученным Г. Ф. Гаузе и его сотрудниками.

Сравнивая результаты подавления роста биохимических мутантов с пониженной способностью к поглощению кислорода с действием тех же культуральных жидкостей на раковые клетки по методу, основанному на подавлении дегидразы опухолей, В. А. Талызина получила следующие результаты.

Цифры означают количество препаратов.

Приведенные в таблице данные показывают, что из 46 изученных препаратов, подавляющих дегидразу тех или иных опухолей, 16 полностью, а 22 частично подавляли рост Staph. aureus 209 УФ-3. Только два препарата, подавляющие дегидразу опухолей, не влияли на рост Staph aureus 209 УФ-3.

При сравнении результатов, полученных при испытании на животных и в пробах с мутантами, установлено несовпадение результатов в 41,6% случаев. Тем не менее, эти данные представляют несомненный интерес. Для окончательного решения вопроса о пригодности биохимических мутантов при поисках новых противоопухолевых антибиотиков требуется дальнейшая работа.

Сравнительное испытание препаратов по методу, основанному на подавлении дегидразы опухолей, и в пробе с мутантами