Методы определения противоопухолевого действия антибиотиков

*Испытанные препараты разбиты на группы по их активности, определенной на основании подавления дегидразы.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ:

«+» - полное подавление дегидразы или роста;

«+/-» - частичное подавление дегидразы или роста;

« » - отсутствие подавления дегидразы или пышный рост.

Использование опухолевых клеток, выращенных in vitro, для отбора организмов, образующих противоопухолевые антибиотики.

Оказалось возможным культивировать некоторые опухолевые клетки в искусственных условиях (in vitro) подобно тому, как это осуществляется в отношении микроорганизмов. Лейкемические клетки мышей могут расти и размножаться в среде, содержащей пептон, диализированную лошадиную сыворотку и фолиевую кислоту A0 мкг/мл). Это позволяет использовать перевиваемые штаммы клеток рака человека для изучения противоопухолевого действия некоторых антибиотиков. С этой целью клетки перевиваемых штаммов выращивают в матрацах Ру на специальной среде с добавлением 10%-й телячьей сыворотки. Культивирование проводят при 36 °С. Через 6-7 сут среду удаляют и слой клеток снимают с поверхности стекла 0,02%-м раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты. Через 15-20 мин инкубации в термостате клетки переходят в суспензию. Способность некоторых опухолевых клеток размножаться в пробирках позволяет применять их в качестве тест-объекта при поиске, выделении и очистке новых антибиотических веществ, обладающих противоопухолевой активностью. С этой целью можно использовать опухолевые клетки лимфолимы. Для получения асцита клеток лимфолимы белым мышам внутрибрюшинно вводят по 0,3 мл взвеси асцитных клеток. Через 10-12 дней асцит стерильно отбирают и сразу же вносят в пробирки с вышеназванной средой. Количество среды в каждой пробирке 2 мл. Оптимальная концентрация опухолевых клеток составляет 3*106 - 5*106 в 1 мл среды. При этих условиях через 48 ч инкубации при 36,5°С в пробирках без перемешивания число клеток увеличивается в 1,5-2 раза. Размножение клеток в культуре оценивают в камере Горяева. Если исследуемый препарат тормозит развитие и размножение клеток асцита, то это указывает на его антиопухолевое действие. Применение метода позволяет проводить первичный отбор противоопухолевых антибиотиков на стадии культуральной жидкости, а также выделять и химически очищать отобранные антибиотики. Причем удается обнаружить и выделить противоопухолевые антибиотики, не обладающие подавляющим действием в отношении обычных тест-организмов, биохимического мутанта стафилококка и не влияющие на дегидразную активность опухолевых клеток лимфолимы.

Использование тест-микробов для первичного отбора противоопухолевых антибиотиков.

При поисках антибактериальных антибиотиков широко применяются контактные методы. При этом определяется бактерицидное или бактериостатическое действие испытуемого препарата на микробов in vitro. Для первичного отбора противоопухолевых антибиотиков также очень удобно иметь тест-микробы, подавление роста которых шло бы параллельно торможению роста опухолей. Ряд авторов считает, что для отбора противоопухолевых антибиотиков следует пользоваться широким бактериальным спектром. При этом метод испытания с использованием тест-микробов может служить в качестве лишь вспомогательного, так как корреляция между антибактериальным и противоопухолевым действием далеко не всегда имеет место.

Г.Ф. Гаузе в 1957 году высказал предположение о возможности направленного изменения обмена у микробов, приближая его к обмену в опухолях. Полученные же при этом микробы с измененным обменом веществ могут быть, по мнению, автора, использованы в качестве тест-объектов для отбора противоопухолевых препаратов.

Метод отбора продуцентов и противоопухолевых препаратов с использованием биохимических мутантов заключается в следующем. На чашку Петри заливают специальную среду. На поверхность застывшего агара накладывают блоки с продуцентами или диски из фильтровальной бумаги, пропитанные препаратом. Радиально от диска или блока штрихами сеют культуру биохимического мутанта и исходную. Подавление роста мутантной культуры при хорошем росте исходной говорит о наличии противоопухолевой активности у испытуемого препарата.

Г.Ф. Гаузе и его сотрудникам удалось получить биохимические мутанты с поврежденным окислительно -восстановительным процессом у следующих микроорганизмов: Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus aurelts 209, Escherichia paracoli, Escherichia coli, Bacillus mycoides и Polytoma uvella.

При воздействии на полученные мутанты препаратов с заведомым противоопухолевым действием они наблюдали торможение или полное подавление роста мутантного штамма при хорошем росте исходного. Такая избирательность в действии на мутантную культуру представляет несомненный интерес.

Однако при более детальном изучении и анализе накопленного материала было установлено, что из всех полученных биохимических мутантов пригодным для первичного отбора противоопухолевых антибиотиков оказался только мутантный штамм Staphylococcus aureus 209 УФ-3. Корреляция между противоопухолевым и антибактериальным действием имеет место лишь при использовании указанного мутанта. Следовательно, первичный отбор противоопухолевых препаратов можно производить на основании их влияния на рост мутантного штамма Staphylococcus aureus 209 УФ-3.

Однако следует отметить, что и этот метод, позволяющий легко и быстро получать ответ, имеет тоже свой недостаток. В пробе с мутантом Staphylococcus aureus 209 отбираются препараты, обладающие противоопухолевым действием в отношении той или иной опухоли. Для определения же опухоли, чувствительной к данному препарату, необходимо далее его дополнительно испытывать каким-то другим методом.

На возможность применения мутантов микроорганизмов, причем преимущественно дрожжей, с нарушенной цитохром-оксидазной системой, в качестве модели для отбора противоопухолевых препаратов указывает также Тоферн.

Установлено, что по характеру обмена веществ к опухолевой клетке ближе стоят анаэробные бактерии по сравнению с аэробными. Основываясь на этом, Брэднер, Брэднер и Кларк, а также Ди Паоло и Розенфилд считают, что в качестве тест-микробов целесообразнее использовать различные анаэробные бактерии.

Определение противоопухолевого действия препарата на основании подавления активности дегидраз опухолевых клеток.

Для отбора противоопухолевых препаратов японские исследователи Кикучи и Матсузава использовали способность неповрежденных опухолевых клеток асцитного рака Эрлиха окрашиваться растворами 2-3-5-трифенил-тетразолиум хлорида. Окрашиваемость клеток зависит от активности окислительных ферментов дегидраз. Под влиянием противоопухолевого препарата активность дегидраз снижается, что сказывается в ослаблении окрашиваемости опухолевых клеток.

В 1956г. Миямура предложил для первичного отбора метод, также основанный на подавлении противоопухолевыми препаратами активности дегидраз опухолевых клеток асцитного рака Эрлиха. В качестве индикатора активности дегидраз автор использовал метиленовую синь, восстанавливающуюся в анаэробных условиях. Препарат испытывали на чашках Петри, залитых специальной средой, содержащей клетки асцитного рака Эрлиха. Испытуемый препарат наливают в цилиндрики, и его влияние на опухолевые клетки происходит в результате диффузии в среду. Об активности препарата судят по наличию синих зон невосстановленной метиленовой сини, свидетельствующих о подавлении активности ферментов дегидраз.

Простота постановки опыта, быстрота и возможность испытания большого количества образцов позволяют использовать данный метод для первичного отбора.

Этот метод также не лишен недостатков. Прежде всего следует указать, что испытание проводится лишь на одной опухоли. Далее действие препарата может сказаться только в том случае, если он диффундирует в агаровую среду. Кроме того, неудобством метода является и то, что восстановление метиленовой сини происходит в анаэробных условиях.

Некоторые исследователи определяли возможность применение клеток других асцитных опухолей. Это расширяет число опухолей, используемых при первичном отборе противоопухолевых препаратов по методу Миямура.

Так, Ямамото и др., Умезава, Такэути и др., Мизуно и др., кроме клеток асцитного рака Эрлиха мышей, применяются клетки асцитной саркомы крыс Иошида.

С целью упрощения техники испытания ряд авторов метиленовую синь заменил 2,6-дихлорфенолиндофенолом, восстанавливающимся в аэробных условиях.

Кроме перечисленных редокс-индикаторов, некоторые исследователи применяют трифенил-тетразолиум хлорид.

Одним из недостатков метода Миямура является возможность испытания только диффундирующих препаратов. Для устранения этого недостатка, значительно ограничивающего число испытываемых препаратов, Араи и Сузуки модифицировали метод Миямура, изменив технику испытания. Кроме того, они заменили довольно сложную среду 1% агаром, приготовленным на фосфатном буферном растворе с рН=6,98. Принцип определения противоопухолевого действия препаратов остался прежним. Авторы предложили проводить испытание не в чашках, а в узких маленьких пробирках, что дает возможность оставить в качестве индикатора метиленовую синь. Поскольку поверхность соприкосновения с воздухом незначительна, не требуется специальных мер для создания анаэробных условий.

Предварительный контакт опухолевых клеток с препаратом с последующим промыванием их и отмыванием испытуемого препарата позволяет исключить возможное влияние самих препаратов на восстановление метиленовой сини.

Помимо клеток асцитного рака Эрлиха, эти авторы используют клетки амиталовой асцитной саркомы и лейкоциты морской свинки. Применение последних дает возможность судить о токсичности и избирательности действия препарата.

Как можно видеть из перечисленных работ, спектр используемых опухолей расширялся за счет различных асцитных форм. Для первичного отбора противоопухолевых препаратов на основании подавления активности дегидраз можно пользоваться взвесями опухолевых клеток, приготовленных из любой солидной опухоли. Это значительно увеличивает возможность использования данного метода для первичного отбора противоопухолевых антибиотиков.

Некоторые исследователи использовали для этой цели взвеси культур клеток перевиваемых штаммов опухолей человека HeLa. Ямамото и др. изучали действие имеющихся различных противоопухолевых препаратов на измельченную человеческую опухоль, только что удаленную у больного. Эффективность препарата определяли на основании подавления активности дегидраз данной опухоли с помощью редокс-индикатора 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Подобные исследования представляют особенный интерес, так как открывают пути возможного индивидуального подбора препарата для воздействия на опухоль у данного больного.

Для реакции с редокс-индикатором необходимы дегидразы. Рекомендуется первичный отбор противоопухолевых препаратов производить, используя экстракты из ряда опухолей (как асцитных, так и солидных), содержащих дегидразы.

Испытан ряд антибиотиков и культуральных жидкостей по этому методу и параллельно в опытах на животных с развивающимися опухолями.

Как показали исследования, активные антибиотики подавляют дегидразы не всех опухолей, а одной или нескольких.

Это указывает, по-видимому, на то, что дегидразы разных опухолей неидентичны.

Большим преимуществом применения экстрактов по сравнению с взвесями клеток является возможность хранения их в замороженном состоянии в течение нескольких месяцев без потери ими дегидразной активности.

Список использованной литературы.

1.       Маевский М.М. Противоопухолевые антибиотики: - М.: Государственное изд. медицинской литературы, 1962. – 311с.

2.       Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: - М.: Высшая школа, 1986. – 448с.

3.       Егоров Н.С Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности: М.: Высшая школа, 1965. – 212с.

4.       Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики: - М.: Мир, 1985. – 272с.

7