Приготовление фиксированных микропрепаратов длительного хранения

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ «ФАРМАЦИЯ»

 

КАФЕДРА ОБЩЕЙ, БИОЛОГИЧЕСКОЙ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ХИМИИ И ФАРМАКОГНОЗИИ

Желтышева Г.В.                                               Студент 2 группы 3 курса

Курсовая  работа по фармакогнозии.

Приготовление фиксированных микропрепаратов  длительного хранения

 

Научный руководитель:__________________________________________________

                                       (должность, ученая степень, фамилия, имя, отчество полностью)

.    

 

 

 

 Работа  защищена « » 20___г

ОРЕЛ-2012г.

 

Содержание

 

 Введение

 

Глава 1. Предварительный этап подготовки сырья к изготовлению микропрепарата

1. Способы подготовки образцов для приготовления фиксированных препаратов
2. Фиксация микропрепарата как способ длительного хранения
3. Общий алгоритм приготовления фиксированного (постоянного) микропрепарата.

Глава 2. Методика приготовления микропрепаратов различных морфологических групп.

1. Методика приготовления микропрепаратов листьев, трав, цветков
2. Методика приготовления микропрепарата цельной коры
3. Методика приготовления микропрепарата цельных подземных органов
4. Методика приготовления микропрепаратов цельных плодов и семян
5. Приготовление микропрепаратов растительных порошков

Заключение

Список использованной литературы

 

 

 

Введение

 

Изготовление микропрепаратов  это неотъемлемая часть фармакогностического анализа, а точнее его части – микроскопического анализа, который предполагает выборку анатомических признаков лекарственного растительного сырья различной степени измельченности.

Целью микроскопического  анализа сырья является обычно установление его подлинности; поэтому, рассматривая его под микроскопом, необходимо сосредоточить все свое внимание на тех признаках, которые отличают определенный орган одного растения от того же органа другого растения. Такие признаки называются диагностическими, а микроскопический анализ сводится к их нахождению. Необходимо знать диагностические признаки каждого растительного органа и приготовлять препарат так, чтобы обеспечить наилучшую возможность их найти и рассмотреть.

Именно с этой целью  необходимо четко знать методы и приемы изготовления как временных, так и фиксированных микропрепаратов.

Фиксированные (постоянные) микропрепараты обладают одним из важным достоинством – они могут храниться десятки лет. Этот фактор позволяет не стоять медицине на месте, помогает ей двигаться вперед.

Техника приготовления  микропрепаратов довольно разнообразна. И зависит от состояния объекта, а также от его принадлежности к определенной морфрлогической группе – листья, кора, подземные органы, плоды.

Именно этот фактор обуславливает  цель данной курсовой работы – определить алгоритм технологии приготовления  фиксированных микропрепаратов длительного хранения для различных морфологических групп.

Значение выбранной темы для расширения научных знаний в фармацевтической области обуславливает актуальность данной работы.

Задачами работы являются:

• теоретическое освоение способов подготовки образцов для приготовления фиксированных препаратов;
• ознакомление с методикой приготовления постоянных препаратов различных морфологических групп.

 

 

 

  

 

 

Глава 1. Предварительный этап подготовки сырья к изготовлению микропрепарата.

 

1. Способы подготовки образцов для приготовления фиксированных препаратов.

 

 

Начальным этапом изготовления микропрепаратов, как временных, так  и фиксированных (постоянных), является подготовка образца (сырья) к приготовлению. Анализ измельченного образца начинают с внешнего осмотра, который проводят на сухом материале визуально или с помощью лупы х 10, желательно при дневном освещении. Отмечают цвет, опушенность, наличие каких-либо дополнительных признаков, проверяют запах при растирании кусочков сырья между пальцами, определяют морфологическую группу ЛРС.

Сухое растительное сырье перед  работой следует размягчить. С учетом особенностей объекта применяют холодное размачивание, кипячение, размягчение в водных парах во влажной камере и другие.

Холодное размачивание. Самый распространенный способ размягчения сырья, рекомендуемый для всех органов растения. Исследуемое сухое сырье помещают в колбу со смесью вода—глицерин (2:1) или вода—96 %-ный спирт—глицерин (1:1:1) с добавлением фенола или другого консерванта. В течение 1—2 суток размачивают мелкие семена, плоды, листья, травы, цветки.

Коры, корни, корневища, твердые  плоды и семена с плотной кожурой, толстые стебли рекомендуется размачивать 3—5 суток. Для этих же объектов можно  воспользоваться мацерацией в воде в течение 1—3 ч для набухания; затем объекты переносят в смесь глицерина со спиртом (1:1) и выдерживают 1—3 суток. Для уплотнения тканей материал помещают на 20—30 мин в спирт или в смесь спирт—глицерин (2:1).

Размягчение в  парах воды. Главным отличием от холодного размачивания является отсутствие контакта сырья с водой. Способ более длительный, однако он гарантирует сохранность структуры и содержимого клеток, предохраняя его от вымывания, возгонки, чрезмерного набухания или ослизнения. Размягчение проводят во влажной камере, которой может служить колба или эксикатор с водой. Сырье в камере находится в чашке или стаканчике и увлажняется водяными парами. Объекты мягкие и тонкие оставляют в атмосфере камеры на сутки, твердые — на 2 и более суток.

Горячий способ размягчения.

Размягчение в воде. Наиболее простой и быстрый способ заключается в кипячении сырья в воде. Тонкие листья и цветки не требуют сложной и продолжительной подготовки. Их обычно размягчают, погружая в горячую воду. Небольшие кусочки растительного материала длиной 1—2 см обычно кипятят 3—5 мин; кору и подземные органы растений — 20—30 мин, в зависимости от плотности и степени одревеснения тканей.

Плоды и семена не кипятят, а распаривают: помещают в марлевом мешочке на 15—30 мин в пары кипящей воды так, чтобы они не были погружены в воду.

Nb! Следует помнить, что путем вымачивания или кипячения сырья в воде из клеток удаляется водорастворимое содержимое. Крахмальные зерна при кипячении в воде клейстеризуются.

Размягчение в растворе щелочи. Для размягчения и одновременного просветления кусочки листовой пластинки (с краем листа, участком главной жилки) помещают в фарфоровую чашку или химический стаканчик и кипятят в 3—5 %-ном растворе натрия (калия) гидроксида в течение 2—5 мин в зависимости от толщины объекта. Жидкость сливают, а сырье промывают водой. Обработанный материал оставляют в воде и готовят из него препараты с поверхности.

Препараты кожуры плодов и семян готовят после кипячения  в 5%-ном растворе натрия гидроксида в течение 15—20 мин, с последующим раздавливанием и разделением тканей.

Размягчение в  растворе хлоралгидрата. Для быстрого приготовления срезов коры и подземных органов их размягчают и просветляют кипячением в растворе хлоралгидрата в течение 10—20 мин.

Разрушение  тканей. В некоторых случаях требуется разрушение тканей. Для изучения отдельных элементов проводящих пучков и механических тканей кусочки сырья длиной 1—2 см или грубый соскоб нагревают (осторожно, под тягой!) в пробирке в смеси 2 мл кислоты азотной концентрированной и 0,3 г калия хлората (бертолетовой соли) до образования пены и оставляют на несколько минут до побеления кусочков. Сырье промывают несколько раз водой, помещают на предметное стекло, разделяют препаровальной иглой на отдельные элементы и просматривают в глицерине.

При исследовании сырья, содержащего секреторные ходы, млечники, вместилища со смолой или эфирным маслом, для разделения тканей без разрушения тонких оболочек клеток применяют следующие способы:

а) кипячение в 3—5 %-ном растворе щелочи в течение 30 мин;

 б) нагревание сырья  в колбе со шлифом в 25 %-ном  растворе аммиака в течение  40 мин. После кипячения частицы  сырья промывают водой, помещают  на предметное стекло и разделяют ткани препаровальными иглами.

1.2. Фиксация микропрепарата как способ длительного хранения.

Отличие временного препарата от постоянного заключается в том, что временный препарат может храниться  относительно не долгий отрезок времени, а постоянный – десятки лет.

Существуют готовые  наборы для изготовления постоянных препаратов. В их состав, как правило, входят: предметные стекла, покровные стекла, этикетки для микропрепаратов, готовые микропрепараты, пинцет, канадский бальзам, краситель метиленовый синий, краситель  Эозин, образцы плодовой мушки. Надо отметить тот факт, что такие наборы имеют свои ограничения для изготовления фиксированных (постоянных) препаратов.

Техника приготовления фиксированных микропрепаратов фармацевтических материалов разнообразна. Она зависит от состояния, в котором находится сырье — цельное, резаное или порошкованное, или от принадлежности его к определенной морфологической группе — лист, кора, подземный орган.¹

Обязательным  условием для долгосрочного хранения препарата из растительного или животного материала является его фиксация.

Фиксация микропрепаратов - процедура прикрепления (фиксации) исследуемого материала, включая бактериальную суспензию, к поверхности предметного стекла. Фиксация микропрепаратов обеспечивает прикрепление микробов к стеклу для предупреждения их смывания в процессе последующей обработки; уничтожение микробов для обеспечения безопасности - работы с заразным материалом; предупреждение аутолиза клеток; лучшее восприятие красок. Осуществляют тепловым и химическим способами. При тепловой (жаром) фиксации высушенный препарат проводят 2 - 3 раза над пламенем горелки. Этот способ нарушает целость структур и может быть использован только по отношению к бактериям и грибам, имеющим толстую ригидную клеточную стенку. Менее глубокие изменения формы и структуры вызывает фиксацию с помощью растворов химических веществ или их смесей. Для фиксации микропрепаратов применяют метанол (5 мин), этанол (15 мин), смесь Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира) (15 мин), смеси Ценкера, Шаудина, Боуэна (смесь пикриновой кислоты -75 мл, формальна- 25 мл и ледяной уксусной кислоты - 5 мл). Фиксация микропрепаратов для электронной микроскопии должна минимально нарушать структуры объекта. Для этой цели используют глютаральдегид, тетраоксид осмия, обычно в щелочном фосфатном или ацетат - вероналовом буфере.² 

Фиксирующих жидкостей (фиксирующих сред) много, самые доступные из  них:  этиловый спирт  и продающийся в аптеках препарат на основе формалина – формидрон. Состав формидрона: 100 мл препарата содержат 10 г раствора формальдегида в пересчете на 37 % формальдегид; вспомогательные вещества: спирт этиловый 96 %, одеколон, вода очищенная.

Препарат формидрон может быть использован для создания архива биологических объектов, вспомогательные вещества входящие в аптечный препарат не сколько не мешают  в сохранении объекта.

Надо отметить, что формальдегид обладает раздражающим действием.

Если на дне банки  с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его  можно растворить, подогрев до 70-80 °С (в вытяжном шкафу или на открытом воздухе), и использовать для фиксации.

Спирт-формол по Шафферу - 10 %  формалин, который готовят из 1 части  40 % формалина и 2 - 3 частей 96 % спирта.

Продолжительность фиксации 24 - 48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт.

Выпадение белого осадка никак не сказывается на свойстве фиксатора.

В ходе приготовления микропрепаратов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами, так как практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам.

Фиксация необходима с целью остановки (прекращения) жизнедеятельности клеток. Для этого объект помещают на несколько часов в фиксатор.

 

1.3. Общий алгоритм приготовления фиксированного (постоянного) микропрепарата.

1. Изучаемый объект  помещают  в раствор 1части ФОРМИДРОНА  с 2 частями воды на несколько дней.

Для мазков это время  ограничивается 15 минутами и формидрон  разводить не следует.

2. После фиксации  объект  отмывают от фиксатора. С этой целью его помещают на несколько часов в проточную воду. Для удержания объекта при отмывке удобно поместить его  в ситечко-шарик для заваривания чая. Исследуемый объект переносят в батарею спиртов с целью удаления воды.

Мазки ополаскивают в проточной  воде в течение 3-5 минут. Струя воды должна быть не сильной, мазок сушат.

3. Далее если необходимо препарат может быть окрашен одним из доступных красителей.

4. После окраски препарат готовят  к заключению в монтирующую  среду.

Приготовить батарею (ряд флаконов) растворов спиртов для удаления воды.  Возможно использовать как этиловый спирт (антисептический раствор) так и Изопропиловый спирт (ИПС) который можно приобрести в магазинах специализирующихся на продаже радиодеталей.