Приготовление фиксированных микропрепаратов длительного хранения

Последовательно наливают в лабораторные стаканчики этанол или изопропанол в концентрациях 50%, 70%, 96%, 99%.

Объект помещают в  стаканчик,  начиная с 50% этанолом на 10 минут. Затем перемещают объект в стаканчики с все более высокой концентрацией спирта, выдерживая в каждом по 10 минут. В процессе такого перемещения этанол будет плавно вытягивать воду из объекта. Помещать объекты сразу в концентрированный этанол нельзя, так как в этом случае, быстро выходящая из клеток вода может повредить клеточные оболочки

Для мазков столь долгое пребывание в спиртах не нужно, достаточно 30-60 секунд, так как некоторые красители  могут вымываться из мазка.

5. Если заключить препарат  в канадский бальзам обезвоженный материал переносят в уайт-спирит  на 5-6 часов,  Канадский бальзам можно заменить на раствор канифоли  в  уайт-спирите, по консистенции напоминающий сироп.

6. Если препарат заключается в глицерин-желатиновую смесь, то объект переносят не уайт-спирит, а в глицерин на несколько часов (глицерин, аптечный)

Заключение объекта  в глицерин-желатин. На нагретое предметное стекло с помощью стеклянной палочки наносят каплю расплавленного глицерин-желатинового реактива. В каплю сразу же помещают размягченный объект или срез, который быстро накрывают покровным стеклом, избегая образования пузырьков воздуха. К препарату приклеивают этикетку с наименованием.

Приготовление глицерин-желатинового реактива. К 1,0 г чистого желатина приливают 50 мл воды для набухания. Излишек воды отцеживают, прибавляют 6 мл очищенной воды, нагревают до растворения желатина, к раствору прибавляют 7 г чистого глицерина и перемешивают. На 100 мл реактива в качестве консерванта прибавляют 1—2 кристаллика фенола. Смесь нагревают на водяной бане в течение 10—15 мин, пока раствор не станет прозрачным. Фильтруют на горячей стеклянной воронке через фильтровальную бумагу. При появлении осадка тщательно профильтруют через стекловату. Реактив хранят в конической колбе, закрытой корковой пробкой, в центр которой вставлена стеклянная палочка, доходящая почти до дна колбы.³

Небольшой кусочек глицерин-желатина иглой или скальпелем переносят  на предметное стекло. Последнее слегка нагревают на спиртовке, глицерин-желатин расплавляется. В него из глицерина переносится объект и покрывается покровным стеклом.

Мазок заключают  следующим образом, кусочек глицерин-желатина помещают на покровное стекло Последнее слегка нагревают на спиртовке, глицерин-желатин расплавляется, объект покрывается покровным стеклом.

Пространство между предметным и покровным стеклом заполняется  монтирующей средой, которая, соединяет покровное и предметное стекла и консервирует объект. Самым главным требованием к монтирующей среде является соответствие ее коэффициента преломления света к аналогичному показателю стекла.

7. Заключение объекта в канифоль  или канадский бальзам

На покровное стекло по центру наносят  каплю или, если стекло длинное, две  капли жидкого раствора канифоли. Покровное стекло помещают каплей вниз  и слегка прижимают

Края покровного стекла не следует  вытирать ватой или марлей, смоченной  ксилолом, так как при этом часть  смолы может растечься по чистой поверхности покровного стекла. Засыхая, она образует неровности, которые мешают наблюдению под микроскопом и от которых очень трудно избавиться.

В результате неполного  обезвоживания в окрашенных заключенных  препаратах часто образуются непрозрачные или мутные зоны. Под микроскопом  в таком участке среза и над ним обнаруживаются многочисленные мелкие капельки воды, окраска сильно выцветает. Чтобы избавиться от этого, снимают покровное стекло, смывают ксилолом синтетическую смолу или бальзам, обезвоживают срез в 100%-ном спирте, ацетоне или изопропиловом спирте, просветляют в смеси ксилола с обезвоживающим агентом и в 2-3 сменах свежего ксилола и вновь заключают.

Микропрепараты можно  разделить на сухие и влажные. Влажные препараты - препараты, в котором образец не может обходиться без воды, чтобы оставаться живым. Что касается сухих микропрепаратов, то для их приготовления не используется вода. На предметное стекло помещается очень тонкий срез образца, который накрывается покровным стеклом. После этого покровное стекло можно слегка придавить. Эту процедуру необходимо проводить в резиновых перчатках, во избежании следов.

 

Глава 2. Методика приготовления  микропрепаратов различных морфологических  групп.

Полный алгоритм техники  микроскопического анализа приведен и описан в общей фармакопейной  статье «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья»,  ГФ XI, выпуск 1.

2.1. Методика приготовления микропрепаратов листьев, трав, цветков

Растительный материал, отобранный для микроскопического  изучения, помещают в пробирку и проводят его обработку для просветления:

растительный материал заливают 2—3% раствором едкого натра  и кипятят в течение 1—2 мин. После этого жидкость осторожно сливают, а материал тщательно промывают водой и помещают в чашку Петри. ⁴

Кусочки сырья вынимают из воды с помощью скальпеля (или лопаточки) и препаровальной иглы и помещают на предметное стекло в каплю раствора глицерина или воды.

Допускается другой способ просветления – кусочки сырья  кипятят в пробирке в растворе хлорагидрата несколько минут (во полного просветления).⁵

На предметном стекле его кусочек 4 мм разделяют скальпелем или препаровальной иглой на две части; одну из них осторожно переворачивают, чтобы получить возможность наблюдать лист под микроскопом с верхней и нижней сторон.

Стекла, используемые для приготовления микропрепаратов, должны быть чистыми и сухими.

Препарат на предметном стекле накрывают  покровным стеклом. При неосторожном накладывании покровного стекла в препарате часто образуются пузырьки воздуха, поэтому стекло следует класть наклонно, прикоснувшись сначала одним краем к жидкости, а затем, придерживая стекло иглой, положить полностью. Попавшие пузырьки воздуха можно удалить легким постукиванием по покровному стеклу тупым концом препаровальной иглы или слегка подогреть над пламенем горелки. После охлаждения рассматривают под микроскопом, сначала при малом, затем при большом увеличении.

Если включающая жидкость не заполняет всего пространства между предметным и покровным  стеклом или она испарилась при  нагревании препарата, то ее добавляют сбоку небольшими каплями. Если наоборот, покровное стекло свободно плавает вследствие избыточного количества жидкости, то ее следует отсосать при помощи полоски фильтровальной бумаги, подведенной сбоку.

При приготовлении микропрепарата из толстых листьев предварительно раздавливают скальпелем толстые жилки, а с пластинки стараются снять эпидермис или, размяв лист, отделяют мезофилл от эпидермиса, чтобы препарат был более тонким.

2.2. Методика приготовления микропрепарата цельной коры

Готовят поперечные или  продольные срезы коры. Кусочки коры размером 2—3 х 0,5—1 см кипятят в пробирке с водой в течение 5 мин.

Размягченные куски выравнивают скальпелем так, чтобы они имели строго поперечное или продольное сечение. Делают срезы и готовят микропрепараты в растворе глицерина.

Тонкие коры режут  в пробке, как при подготовке срезов из листьев и трав.⁶

Одревесневшие (лигнифицированные) элементы. К срезу на предметное стекло прибавляют несколько капель раствора флороглюцина и 1 каплю 25% раствора серной кислоты. Через минуту жидкость отсасывают полоской фильтровальной бумаги, срез заключают в раствор глицерина и закрывают покровным стеклом (рассматривают без прогревания); одревесневшие механические элементы окрашиваются в малиново-красный цвет.⁷

Крахмал. Для обнаружения  крахмала делают соскоб с сухой коры и рассматривают его в растворе Люголя. Крахмальные зерна окрашиваются в синий цвет.

2.3. Методика приготовления микропрепарата цельных подземных органов

Для изготовления микропрепарата необходимо подготовить поперечные и продольные срезы. Для размягчения небольшие кусочки размачивают в растворе глицерина в течении 1-3 суток в зависимости от твердости.⁸ Размоченные объекты выравнивают скальпелем или бритвой так, чтобы они имели строго поперечное или продольное сечение. Делают срезы и готовят микропрепараты в растворе глицерина и рассматривают диагностические признаки сначала при малом, затем при большом увеличении. Сначала срезают бритвой более толстые, но цельные ломтики, затем делают срезы тонкие и более мелкие. Цельные ломтики окрашивают раствором анилина сульфата, флороглюцином с 25%-ной серной кислотой или раствором сафранина.

2.4. Методика приготовления микропрепаратов цельных плодов и семян.

Готовят препараты кожуры семени и околоплодника с поверхности и поперечные срезы.

Препараты кожуры семени и околоплодника с поверхности. 2—3 семени или плода кипятят в  пробирке в растворе 5% едкого натра  в течение 2—3 мин и тщательно промывают водой.

Объект помещают на предметное стекло, препаровальными иглами отделяют кожуру семени или ткани околоплодника и рассматривают их в растворе глицерина.

Срезы. Для приготовления  срезов сухие плоды и семена предварительно размягчают, поместив их на сутки во влажную камеру (влажной камерой  служит эксикатор с водой, в которую добавлено несколько капель хлороформа) или водяным паром в течение 15—30 мин или более в зависимости от твердости объекта.

Мелкие плоды и семена запаивают в парафиновый блок размером 0,5 х  0,5 х 1,5 см.

Кончиком нагретой препаровальной иглы расплавляют парафин и в образовавшуюся ямку быстро погружают объект.

Срезы объекта делают вместе с парафином; срезы выбирают из парафина препаровальной иглой, смоченной жидкостью, и готовят микропрепарат в растворе глицерина.

В порошке плодов диагностическое значение имеют обычно механические элементы, обрывки эфирномасличных канальцев (для зонтичных), иногда расположенные на эпидермисе плода волоски.⁹

При изучении семян под  микроскопом обычно обращают внимание на общее строение семени (характер кожуры, величину запасной питательной ткани — эндосперма, форму и расположение зародыша — корешка, семядолей, почечки зародыша).

Более детально изучают кожуру семени, которая почти всегда состоит из нескольких слоев характерного строения.

Наиболее важное диагностическое значение имеет механический слой кожуры, который состоит или из вытянутых элементов (типа волокон), или из округлых, изодиаметрических.

Строение эндосперма и тканей зародыша, как правило, у всех растений мало, чем отличается, поэтому не имеет диагностического значения.

 Лишь в некоторых  случаях (у семян чилибухи, плодов зонтичных) эндосперм имеет очень характерное строение и может в числе других служить диагностическим признаком.

2.5. Приготовление микропрепаратов растительных порошков.

  

Микропрепараты растительного  порошка всех морфологических групп  сырья готовят одинаково.

На предметное стекло вначале помещают 2—3 капли раствора хлоралгидрата или глицерина, а затем на кончике скальпеля или увлажненной препаровальной иглы вносят частицы порошка, перемешивают препаровальной иглой до равномерного смачивания всех частиц жидкостью, накрывают покровным стеклом и слегка придавливают ручкой иглы. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги. Если жидкости под стеклом оказалось мало, ее добавляют пипеткой рядом с покровным стеклом (она быстро затягивается под стекло).

Микропрепараты прогревают над небольшим пламенем горелки  или на электроплитке до просветления тканей, не допуская высыхания. Держать  препарат при прогревании следует наклонно, под углом 10—15°,— так из объекта лучше удаляются пузырьки воздуха. Нельзя допустить резкого закипания жидкости, так как при этом частицы порошка не просветляются, а препарат заполняется пузырьками воздуха.

При исследовании порошка коры, подземных органов, плодов или семян основной микропрепарат готовят в растворе хлоралгидрата для изучения главных диагностических признаков, выявления слизи, алейроновых зерен, кристаллов и др. Для обнаружения крахмала микропрепарат приготовляют в воде или глицерине без нагревания. ¹⁰

Химические  реакции. Составной частью микроскопического анализа является проведение гистохимических реакций. С одной стороны, они позволяют установить наличие в ЛРС действующих веществ (жирное и эфирное масло, смолы, содержимое млечников, слизь, инулин, алкалоиды, дубильные вещества и др.) и нередко их локализацию в тканях растения. С другой стороны, при помощи гистохимических реакций определяют различные части клетки, характер оболочки, ее одревеснение, содержимое клеточного сока, включения. Необходимые гистохимические реакции проводят на поперечном срезе размягченного сырья или с порошком (соскобом) сухих органов растения.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

Подводя итоги данной курсовой работы, хотелось бы изложить основные «постулаты» необходимые для приготовления фиксированных микропрепаратов.