Противоопухолевые вакцины

Классификация противоопухолевых

вакцин  

• Вакцины на основе цельных клеток:

аутологичные:

• немодифицированные,

• модифицированные

(трансфекция); аллогенные.

• Аутологичные белки теплового шока.

• Ганглиозиды.

• Синтетические  пептиды.

• ДНК.

• Рекомбинантные вирусы.

• Вакцины на основе дендритных клеток. В настоящее время в большинстве случаев применяют вакцины на основе аутологичных и аллогенных не модифицированных и модифицированных опухолевых клеток, синтетические поливалентные вакцины, вакцины на основе ДК, часто с различными адъювантами. 

Вакцины на основе цельных опухолевых клеток

Аутологичные или аллогенные опухолевые клетки облучают или лизируют с целью инактивации и оптимизации опухолеассоциированных антигенов и вводят вместе с иммунологическим адъювантом(ами) для привлечения АПК хозяина . Традиционным адъювантом, который положительно зарекомендовал себя в такого рода исследованиях, являются живые аттенуированные микобактерии Кальметта–Жерена (вакцина БЦЖ), а также C. рarvum, липополисахарид грамотрицательных бактерий, полный адъювант Фрейнда и др. Воздействуя главным образом на макрофаги, клетки Лангерганса и дермальные дендритные клетки, они способствуют:

• их активации, эффективному распознаванию, процессингу и представлению опухолеассоциированных антигенов на клеточной поверхности,

• продукции  большого количества цитокинов, необходимых для активации и пролиферации хелперных и цитотоксических Т лимфоцитов и усилении ими цитотоксического потенциала,

•лучшей кооперации клеток в иммунном ответе. К такому же результату приводит ксеногенизация ex vivo опухолевых антигенов с помощью введения генетически чужеродного материала в цельные опухолевые клетки или лизаты. С этой целью чаще всего используются аденовирусы, тропные к тканям человека, а также введение в процессе вакцинации лимфокинов или их индукторов, что повышает иммунный ответ. Аллогенные вакцины обычно готовят из смеси опухолевых клеточных линий с известным на сегодняшний день набором опухолеассоциированных антигенов, которые хранятся в банке клеточных культур. Приготовлению аутологичных вакцин предшествует хирургическое вмешательство и наращивание числа опухолевых клеток с индивидуальным спектром опухолеассоцииранных антигенов. Исследования показали, что вакцины на основе опухолевых клеток с адъювантом могут усилить иммунный ответ больного на опухоль, в то же время эти вакцины обладают ограниченной способностью стимулировать специфический иммунитет у больных в развернутой стадии заболевания, часто после без успешного применения более традиционных способов

лечения. Усовершенствование условий получения клеточных  культур аутологичных опухолевых клеток, изучение экспрессии на клеточной поверхности опухолеассоциированных антигенов и молекул МНС, а также их модификация, в том числе под влиянием различных современных иммуноадъювантов, является чрезвычайно важным для дальнейшего развития активной специфической иммунотерапии . 

Геномодифицированные вакцины

В аутологичные или аллогенные опухолевые клетки вводят гены (последовательности экзогенной ДНК), которые вызывают экспрессию или синтез молекул цитокинов, или синтез других белков, активирующих иммунный ответ или обладающих токсическим действием в отношении клеток опухоли . В последнем случае может наблюдаться резкое снижение числа митозов, возрастание числа апоптических клеток и, как следствие,– активация ДК, специфических ЦТЛ, разрушение модифицированных клеток и регресс неизмененных опухолевых клеток. Показано, что экспрессия ИЛ 2, ИФН γ или костимулирующей молекулы В7.1 на опухолевых клетках вызывает активацию ЦТЛ без участия «профессиональных» АПК и Т хелперов хозяина. Однако доклинические исследования показали, что наибольшей противоопухолевой эффективностью обладают вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных колониестимулирующим фактором ГМ КСФ (рис.1). На модели костномозговых химер G. Dranoff и соавт. (1993) показали, что такие вакцины активно привлекают АПК, стимулируют захват и экспрессию опухолевых антигенов, а также способствуют формированию устойчивого противоопухолевого иммунного ответа. На этом основании в последующем стали разрабатывать геномодифицированные вакцины, экспрессирующие или синтезирующие другие иммунореактивные молекулы, но обладающие схожим механизмом стимуляции иммунной системы.

В течение последних  лет проводятся клинические исследования I–II–III фазы модифицированными аутологичными противоопухолевыми вакцинами, в том числе в комбинации с иммунологическими адъювантами или другими модификаторами иммунного ответа. Основным недостатком этого метода является трудоемкость, высокотехнологичность и длительность процесса приготовления вакцины. Поэтому аутологичные геномодифицированые вакцины в ряде случаев стали заменять вакцинами на основе аллогенных опухолевых или неопухолевых клеток (обычно фибробласты). Это оказалось возможным, так как аллогенные опухолевые клетки, геномодифицированные ex vivo, привлекают и активируют АПК in vivo. В результате наблюдается стимуляция ЦТЛ против опухолеассоциированных антигенов в организме с опухолью. Такой подход значительно снижает время приготовления вакцины и может устранять проблему, связанную с продукцией некоторыми опухолевыми клетками иммуносупрессивных веществ. Проводятся клинические исследования противоопухолевых векторных вакцин . Предполагается, что эффективный иммунный ответ можно получить, используя вектор экспрессии, кодирующий вирусные иммуногены так, что синтезируемые белки образуют вирусную частицу путем самосборки. Очевидно, что такие вирусы не будут содержать инфекционной нуклеиновой кислоты. Уже получены и используются на экспериментальных моделях дефектные вирусы ВИЧ. В перспективе предполагается использовать векторы, в которые встроены гены, контролирующие синтез протективных антигенов, и гены, кодирующие различные медиаторы иммунного ответа . Получены рекомбинантные штаммы БЦЖ, которые секретируют γ интерферон, интерлейкины, колониестимулирующий фактор ГМ КСФ. Предварительные исследования свидетельствуют о высокой эффективности этих вакцин в отношении рака мочевого пузыря. Получать эффективную векторную вакцину на основе бактерий достаточно трудно из за нестабильности трансфекции генного материала, токсичности чужеродного антигена для бактерий, малого количества экспрессированного антигена. Частично эти проблемы можно решать с помощью вакцин на основе белков теплового шока, ганглиозидов, синтетических пептидов и «высокопрофессиональных» ДК, в том числе геномодифицированных . 

Вакцины на основе белков теплового  шока, ганглиозидов, пептидов 

В последние  годы большое внимание, с точки  зрения возможности генерирования противоопухолевого иммунного ответа, уделяется белкам теплового шока (heat shock proteins) . Эти белки являются устойчивыми внутриклеточными молекулами, которые, как установлено, содержат потенциально иммуногенные пептиды. Известно, что белки теплового шока специфически связываются с поверхностными структурами АПК, подвергаются эндоцитозу и представлению иммуногенного пептида в ассоцииации с МНС молекулами класса I цитотоксическим Т клеткам . В ряде клинических исследований изучается подобный подход, в том числе при меланоме. При этом из удаленной опухоли выделяют белки теплового шока (например, HSP96) и вводят внутрикожно. Как показали результаты, этот метод безопасен и способен индуцировать противоопухолевый иммунный ответ. В настоящее время предпринимаются попытки комбинированной вакцинации на основе рекомбинантного белка теплового шока (HSP70) совместно с тиразиназой gp100. Другим вариантом вакцин, которые также содержат потенциально иммуногенные пептиды, являются ганглиозидные вакцины. Ганглиозиды – гликолипидные антигены, экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток и вызывающие образование антител. Показано, что на поверхности меланомных клеток наиболее интенсивно экспрессируются ганглиозиды, содержащие как нейтральные сахара, так и сиаловые кислоты. Известно несколько ганглиозидов: GM3, GD3 (основной меланомный ганглиозид), GD2, GM2 и O ацетил GD3 . GM2 является наиболее иммуногенным меланомным ганглиозидом и по этой причине является объектом большинства клинических исследований. Уже первые работы показали тесную связь между наличием в сыворотке больных антител против GM2 и увеличением без рецидивной и общей выживаемости. Образование GM2 IgM было обнаружено у 85% леченых больных. В последующем была разработана новая форма вакцины на основе GM2, связанная с адъювантом (GMK). Эта форма вакцины сопровождается образованием антител у 100% больных . Эффективность GMK вакцины оценивалась у больных меланомой в мультицентровых рандомизированных исследованиях по сравнению с интерфероном α. Первые 16 мес наблюдения за больными не показали увеличения показателей безрецидивной и общей выживаемости больных. Одной из причин отсутствия значимого лечебного эффекта, вероятно, является то, что ганглиозид GM2 экспрессируется на поверхности всех меланомных клеток, но степень его экспрессии незначительна по сравнению с другими ганглиозидами. Менее 20% клеточных линий меланомы могут быть лизированы моноклональными антителами к GM2 и комплементу. Поэтому для получения клинически значимого результата необходимо индуцирование образования антител против других ганглиозидов. В этой связи очевидна целесообразность использования поливалентных вакцин на основе нескольких ганглиозидов. Еще одним вариантом вакцин, которые также активно разрабатываются и исследуются, являются пептидные вакцины. Современные биотехнологические методы позволяют получать синтетические опухолеассоциированные антигенные пептиды в необходимых количествах. Имеются убедительные экспериментальные доказательства того, что пептиды, представляемые иммунной системе в течение нескольких дней, являются высокоиммуногенными. По этой причине проводятся исследования интранодального введения пептидов, в том числе с костимулирующими факторами, адъювантами. Одним из первых было проведено исследование MAGE 3, являющегося пептидом, рестриктированным HLA A1 гаплотипу . Лечебный эффект был зарегистрирован у 6 из 19 больных. Это исследование убедительно показало, что синтетические пептиды являются безопасным и перспективным методом вакцинотерапии. Цитотоксичность Т лимфоцитов против клеток меланомы обратно коррелирует с экспрессией антигена в тканях меланомы.

У больных с  прогрессированием на фоне вакцинотерапии наблюдались варианты с потерей  антигена, что позволяет предположить возможность иммуноселекции опухолевых клонов на фоне вакцинации . Ряд исследований было выполнено в Национальном институте рака (США) по изучению пептидов, полученных из меланомного дифференцировочного антигена gp100. Первоначально лечение проводилось HLA A2+ пациентам с помощью нативного пептида, но в последующем другая группа больных получала лечение белком, в котором изменена одна аминокислота. Этот пептид имеет аффинность к HLA A2*201 выше, чем нативный, что послужило основанием предполагать возможно большую индукцию ответа Т лимфоцитов . После введения ИЛ 2 в периферической крови эти Т лимфоциты не обнаруживались, но лечебный эффект наблюдался, что позволило предположить их миграцию в места локализации антигенов. Были проведены клинические исследования, в которых предпринимались попытки вакцинировать больных меланомой с помощью немутированных антигенов (MAGE, BAGE, RAGE), в том числе в комбинации с иммунологическими адъювантами. Вакцины на основе синтетических пептидов считаются одним из перспективных методов иммунотерапии и активно изучаются в клинике . 

Вакцины на основе дендритных клеток 

Как стало ясно в последнее время, ДК играют важную роль в процессе опухолевой прогрессии . Установлено, что по причине отсутствия ДК в опухоли или слабой экспрессии молекул МНС класса I и II, а также CD80 и CD86 костимулирующих молекул на ДК, инфильтрирующих опухоль, не создается устойчивый антиген специфический Т клеточный ответ. По мнению ряда авторов , это может быть следствием продукции злокачественной опухолью факторов (ИЛ 10, ТФР бета, фактор роста эндотелия и др.), угнетающих дифференцировку, созревание и функциональную активность периферических ДК. При культивировании таких ДК в условиях in vitro, позволяющих получить их максимальный рост и активацию, наблюдается увеличение экспрессии поверхностных молекул, но их уровень оказывается недостаточным для усиления ответа специфических ЦТЛ. Наибольшей способностью к представлению специфического опухолевого антигена Т лимфоцитам у экспериментальных животных с опухолью или у пациентов оказались аутологичные костномозговые предшественники ДК, выращенные в соответствующих условиях in vitro, а также сингенные или аллогенные ДК из периферической крови здоровых индивидуумов, активированные опухолеассоциированными антигенами . Для этого функционально активные ДК инкубируют с антигенами, специфичными для опухоли (пептиды, белки, кДНК или мРНК, кодирующие антиген), с целью получения эффекта представления пептидных фрагментов опухолеассоциированных антигенов в ассоциации с молекулами МНС на поверхностной мембране ДК (рис.2).

 В последующем  ДК, нагруженные антигеном, вводят  больному. Противоопухолевый эффект  достигается повторными процедурами «обработки» и введением ДК в режиме вакцинотерапии. Формирование эффективного противоопухолевого иммунного ответа на вакцинотерапию, как правило, требует от нескольких недель до нескольких месяцев. По

этому клинический  эффект активной специфической иммунотерапии часто является отсроченным. Понятно, что этот метод должен быть эффективным при применении с адъювантной целью в случае так называемой резидуальной опухолевой болезни. При большой опухолевой массе эффективность вакцинотерапии a priori значительно ниже, так как в этих случаях часто наблюдается недостаточное проникновение в опухоль клеток эффекторов, генерированных в результате вацинации. Вакцинотерапия может быть неэффективной у пациентов с быстрым опухолевым ростом, так как при прогрессировании злокачественные опухоли генетически

нестабильны (следствие  мутаций) и это может способствовать «ускользанию» новых опухолевых клонов от распознавания иммунной системой хозяина. Применение современных методов иммунотерапии у больных с диссеминированными опухолями, устойчивыми к традиционным методам лечения, помогает более полно понять эффективность иммунологического ответа, а так же определить место иммунотерапии в комплексном лечении онкологических больных.

При разработке методов вакцинотерапии большое значение имеют лабораторные тесты, результаты которых могут прогнозировать клиническое течение заболевания . К ним относятся: определение внутри цитоплазматического γ интерферона, пептид HLA тетрамеров, ELISPOT тест (enzyme linked immunospot), полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы. Эти тесты позволяют определить количество антигенспецифических Т клеток в периферической крови и способность Т клеток повреждать клетки мишени, экспрессирующие чужеродный антиген. Большие споры вызывает вопрос о выборе материала для лабораторного исследования при оценке эффекта вакцинотерапии: периферическая кровь, опухолевая ткань или дренированные лимфатические узлы. Определение содержания антигенспецифических эффекторных клеток в циркулирующей крови отмечено как наиболее значимое. Вместе с тем важным остается изучение связи лабораторных показателей и отсроченного регресса опухоли. С практической точки зрения, наибольшее значение имеют клинические методы оценки лечебного эффекта (полный, частичный регресс, стабилизация процесса – их продолжительность). В настоящее время рассматриваются различные типы миелоидных ДК, которые могут быть пригодными для клинического использования: 1) выделенные из периферической крови, 2) выращенные ex vivo из их костномозговых предшественников (CD34+–гемопоэтические стволовые клетки), 3) полученные из моноцитов периферической крови. Тип ДК – это определенная стадия созревания гемопоэтической клетки за пределами костного мозга, в которой важная роль отводится типу антигенной стимуляции. Встреча с иммуногенным антигеном способствует их созреванию или активации и может изменить функцию (например, миграцию, стимуляцию Т клеток, продукцию цитокинов и др.). Одновременно оцениваются различные методы доставки антигена для ДК ex vivo. Для активации ДК используют специфические пептиды, но их применение ограничено в связи с зависимостью от HLA типа пациента. При некоторых опухолях опухолеассоциированные антигены остаются неизвестными, поэтому используется