Санитарная микробиология

- общее микробное число (общее количество микроорганизмов в 1 мл),

- наличие патогенных микроорганизмов,

- количество БГКП как показатель  степени фекального загрязнения,

   Дополнительно определяют титр Clostridium perfringens, индекс бактериофага и цисты лямблий.

Наличие патогенных микроорганизмов определяют по эпидемиологическим показателям.

Исследованию подлежат: питьевая вода (водопроводная, колодезная, из артезианских скважин), вода открытых водоемов (реки, озера), плавательных бассейнов, а также сточные воды. Допустимое содержание отдельных видов микроорганизмов в различных водоисточниках  регламентируется ГОСТ ом (государственным стандартом).    

Отбор проб воды 

Для взятия проб воды используют как многоразовую, так и одноразовую стерильную посуду. Многоразовая изготовляется из материалов, выдерживающих обработку сухим жаром и автоклавированием.  Емкости для забора воды закрывают плотными пробками и защитным колпачком из фольги или плотной бумаги.

         Из открытых водоемов пробы берут обычно с глубины 10-15 см  от поверхности, а  из мелководных водоисточников -  на уровне 10-15 см от дна. Для взятия проб используют также специальный аппарат – батометр (рис 2,3). Он состоит из металлического каркаса, в который вставляется бутылка для воды, закрывающаяся плотной пробкой с приспособлением для ее открывания. Этот аппарат укреплен на тросе, позволяющем опускать его на нужную глубину. Батометры часто используются при взятии глубинных проб воды из больших водоемов

Перед взятием проб из водопровода кран протирают тампоном, смоченным  спиртом, и обжигают, после чего 10-15 мин сливают застоявшуюся в трубах воду и только затем отбирают образец для исследования.

                Анализ проводят сразу после взятия проб. При необходимости транспортировки воду сохраняют  при температуре 1-5º С  и анализируют не позднее чем через 2-6 ч с момента ее забора.

1. Определение общего количества микроорганизмов в воде

Общее микробное число воды определяют путем культивирования содержащихся в пробах бактерий в плотных питательных средах. В  зависимости от предполагаемой загрязненности водоема перед посевом готовят десятикратные разведения исходной  пробы в  стерильной водопроводной воде. В таблице № 1   приведены рекомендуемые для посева разведения воды в зависимости от степени ее загрязненности   (объем каждого разведения для дальнейшего посева в МПА составляет 1 мл).

Для получения разведений берут ряд пробирок, содержащих по 9 мл стерильной водопроводной воды. Исследуемую воду в объеме 1 мл вносят в первую пробирку, получают разведение 1:10, затем из этой пробирки переносят 1 мл в следующую и т.д.  (рис.1).    Для приготовления каждого разведения используют новую стерильную пипетку. Из полученных разведений вносят по 1 мл  воды в 2 чашки Петри для подсчета средних показателей.  и заливают 15-20 мл  расплавленного и охлажденного до 45ºС  МПА. Содержимое чашек тщательно перемешивают круговыми движениями, перемещая  их по поверхности стола. После застывания агара, чашки помещают в термостат на 24 ч при температуре 37ºС. Колонии бактерий растут, как на поверхности  питательной среды (аэробы), так и в ее глубине (анаэробы). Подсчитывают их суммарное количество и вычисляют общее микробное число. Если воду предварительно  разводили, то полученную сумму умножают на степень разведения и  в итоге получают количество микроорганизмов в 1 мл исходной воды.

Общее микробное число в 1 мл питьевой воды не должно превышать  50.

Таблица  1. Рекомендуемые для посева разведения воды в зависимости от степени ее загрязненности при определении общего микробного числа (объем каждого разведения для посева составляет 1 мл)

2.Определение бактерий группы кишечной палочки (БКГБ) 

Санитарно-показательными микроорганизмами  в воде, также как и в почве, являются бактерии группы кишечной палочки (БГКП). Они также называются колиформными (от лат. Escherihia coli - кишечная палочка.) Эта группа объединяет   факультативно анаэробных представителей семейства Enterobacteriaceae.  Все они имеют палочковидную форму, не образуют спор, грамотрицательные, оксидазоотрицательные, разлагают лактозу до кислоты и газа. Следует обратить внимание на температуру, при которой наиболее активно проявляются сахаролитические свойства колиформных бактерий. Большинство из  них  сбраживает  лактозу через 24-48 ч при температуре 37ºС. Такие бактерии относят к общим колиформным бактериям (ОКБ). Отличительной особенностью термотолерантных колиформных  бактерий (ТКБ)  является  то, что они разлагают лактозу до кислоты и газа при  более высокой температуре - 44ºС в течение более короткого времени – за 24 ч. Обнаружение  термотолерантных  колиформных бактерий (ТКБ) указывает на свежее фекальное загрязнение воды. Бактерии группы кишечной палочки  выявляются различными методами. Наиболее  распространенным является метод мембранных фильтров.

1.Определение БГКП методом мембранных фильтров

         Для определения БГКП этим методом используют фильтровальный аппарат Зейтца,  (рис. 4), который перед началом исследований  протирают тампоном, смоченным в спирте, стерилизуют прокаливанием и устанавливают на колбе Бунзена. 

Затем в прибор помещают нитрацеллюлозный или ацетатцеллюлозный  мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,45 мкм. Такие фильтры предварительно стерилизуют методом кипячения. Выбранный для исследования объем воды пропускают через фильтр, присоединяя аппарат к вакуумному насосу. Если анализируют несколько проб воды, то для каждой из них используют отдельный мембранный фильтр. Перед фильтрованием новой пробы аппарат стерилизуют. После пропускания через них воды фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри,  располагая их на питательной среде фильтрующей стороной вверх. Чашки затем инкубируют в термостате 24 ч при 37ºС . В состав среды  Эндо входят лактоза, индикатор и МПА и поэтому БГКП образуют на ней колонии красного цвета с металлическим отливом. Подсчитывают  количество таких  колоний, готовят из них мазки и окрашивают по Граму, а также проверяют оксидазную активность. Оксидазоотрицательные бактерии, разлагающие лактозу до кислоты и газа, обнаруженные на фильтре, позволяют дать положительный ответ о наличие в воде БГКП.  При анализе питьевой воды вычисляют количество БГКП, содержащихся в 100 мл.

Для дифференциации ОКБ (общих колиформных бактерий) и ТКБ (термотолерантных колиформных бактерий)  каждую выросшую на фильтре колонию БГКП засевают в две пробирки с лактозной средой. Одну из пробирок предварительно прогревают до 44ºС с  тем, чтобы инактивировать ОКБ. Затем эту пробирку инкубируют при этой же температуре в течение 24 ч (для подтверждения наличия ТКБ). Вторую пробирку с посевом ставят в термостат при температуре 37ºС на 48 ч, чтобы убедиться в наличии ОКБ.

Загрязненную воду открытых водоемов предварительно разводят, как указано в табл. № 1 и для фильтрации используют объем не менее 10 мл. Дальнейшие исследования проводят, как описано выше.

2 Определение БГКП бродильным (титрационным) методом

Этот метод известен также под названием: «двухфазный бродильный метод». Для установления содержания колиформных бактерий в  воде,  исследуемые пробы засевают в глюкозо-пептонную среду (ГПС) для подращивания микроорганизмов. Объемы воды  при этом определяются в зависимости от водоисточника и предполагаемой степени его загрязненности.

1 этап исследования. (1 фаза) Исходный объем  воды делят на несколько порций, которые засевают в различные объемы питательной среды. Например, посев   воды с исходным объемом  300 мл производят следующим образом: два объема по 100 мл засевают в два флакона с 10 мл питательной среды, а 10 объемов по 10 мл той же пробы воды засевают в 10 пробирок, содержащих по 1 мл питательной среды. Посевы инкубируют в термостате при 43ºС в течение 7 -12 ч.  Указанная температура подавляет рост  сапрофитных микроорганизмов, но не влияет на колиформные бактерии.

На 2 этапе (2  фаза) из   флаконов и пробирок, при наличии  в них признаков роста (помутнение, газообразование) делают высевы петлей на чашки Петри со средой Эндо, разделенной на 3-4 сектора, и помещают их в термостат при 37ºС на 18-20ч для того, чтобы получить рост изолированных колоний. Емкости с посевами воды в  среде ГПС, на которых через 7-12 ч  не было признаков роста, оставляют в термостате еще на 24 - 48 ч. Отсутствие роста в них через 48 ч свидетельствует об отсутствии в воде БГКП. При просмотре посевов на среде Эндо обращают внимание на колонии красного, розового, бледно-розового  цвета с металлическим блеском. Делают из них мазки, окрашивают по Граму  и проверяют оксидазную активность, позволяющую дифференцировать ОКБ от других грамотрицательных бактерий. Наличие грамотрицательных, оксидазоотрицательных  палочек свидетельствует о наличие в воде БГКП. Для определения термотолерантных колиформных бактерий по 2-3  лактозоположительные  колонии из каждого сектора со среды Эндо засевают в пробирки с любой средой, содержащей лактозу, предварительно нагретой до 44ºС  и помещают в термостат на 24 ч при той же температуре. Образование в пробирках  кислоты и газа свидетельствует о том, что в исследуемой пробе присутствуют термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ).  Это позволяет сделать вывод о свежем фекальном загрязнении воды.     

Таблица 2. Нормативы безопасности питьевой воды в эпидемическом отношении  по микробиологическим и паразитологическим показателям  (по методическим указаниям «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды»

МУК 4.2.1018-01)